銀杏葉黃酮的研究進展及在飼料中的應用

宋立立，李 倩

（滄州師范學院，河北滄州 061000）

銀杏（Ginkgo biloba）為中生代銀杏科僅存的珍貴樹種，素稱 “植物界的明珠”（張鵬飛等，2017）。中醫典籍記載，銀杏葉可用于作為理血化瘀的藥劑，具有活血化瘀通絡之功效。銀杏葉中含黃酮、銀杏萜內酯等其他化合物共160多種。其中黃酮類化合物藥用價值廣泛，有改善血管循環，拮抗體內血小板活化因子，保護神經系統，抗腫瘤和抗癌等多種藥理學功能（魏雨和張景迅，2018）。同時，將銀杏葉黃酮添加到動物飼料中具有天然無毒、功能多樣及經濟綠色等多種優點。本文就目前銀杏葉黃酮的生物學功能、提取純化工藝、抗氧化性和抑菌性質的研究進展進行簡要綜述，并對銀杏葉黃酮在飼料領域的應用前景進行展望。

1 銀杏黃酮類化合物簡介

黃酮類化合物作為一種天然植物成分廣泛分布于銀杏葉中，其結構中含酚羥基團，使pH呈弱酸性（肖詠梅等，2019）。按分子結構可將40種銀杏黃酮類化合物分為三類：（1）黃酮醇及其苷類，共28種，其中單黃酮類苷元有7種。可以作為標準物來測算總黃酮苷含量。（2）雙黃酮類（二聚體黃酮），分為6種。通常作為裸子植物的特征化學成分。（3）兒茶素類黃酮，分為6種（孫笑槐，2011）。

2 銀杏葉黃酮生物學功能

2.1 改善血管循環 黃酮類的槲皮素可以增加血管內皮細胞中Ca2+濃度，從而啟動血管舒張因子如NO的釋放，并擴散進入平滑肌使血管擴張（朱益等，2004）。 李天一等（2009）通過研究發現，銀杏葉提取物中的黃酮成分可顯著降低患肝肺綜合征大鼠肝、肺組織中的血管擴張因子和內皮素等，對該癥起治療作用。銀杏葉黃酮還可降低血管緊張素轉換酶因子的含量，誘導鳥苷酸環化酶激活血管平滑肌中的cGMP，從而抑制肌球-肌動蛋白復合體信號通路，使血管擴張 （王繡錦和李芝靜，2009）。此外，銀杏葉中黃酮類化合物對血小板凝集和血栓形成有抑制作用，有利于防止和治療動脈粥樣硬化（陳健康和王雷，2001）。

2.2 保護神經系統 銀杏葉中的黃酮成分有抗血管栓和增強代謝的作用，能增加腦血流量，預防和治療多種腦缺血性疾病（孫芳等，2014）。同時其抗氧化作用可以提高機體免疫力，改善心腦血管型癡呆、老年癡呆癥患者和糖尿病患者的血管和腦干細胞功能。羅旭敏等（2005）發現，銀杏葉黃酮中的黃芩甙成分能明顯抑制大鼠腦分區切片上由K+引起的谷氨酸（Glu）釋放，從而有效避免由Glu過度釋放而造成的多種神經性腦損傷。此外，銀杏葉中的黃酮類化合物還能通過抑制去甲腎上腺素、KCl等物質引起的細胞中Ca2+通道的開放，避免Ca2+過度釋放造成的興奮性神經性損傷，對腦細胞具有保護的作用（呂躍瑋和郭建友，2016）。

2.3 抗腫瘤、抗癌作用 銀杏葉黃酮具有預防惡性腫瘤和癌癥的作用，特別是針對原發性的卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌等對雌激素依賴性腫瘤（張立虎等，2019）。其抗腫瘤作用的分子機制包括增強細胞抗氧性、抑制腫瘤細胞的增殖、激活促腫瘤壞死因子、延緩細胞周期、促使分化凋亡、抑制信號轉導及細胞間的相互接觸等。杜輝等（2013）研究得出，銀杏葉黃酮可使人卵巢惡性畸胎瘤PA1阻滯在G1期，但對卵巢的功能細胞沒有損傷。老年腫瘤患者的血液高凝狀態會促進腫瘤增殖及在體內的擴散。蘇雷等（2014）研究發現，銀杏葉黃酮能通過減少血漿纖維蛋白原和D-二聚體的水平來抑制血液高凝狀態，對老年腫瘤有一定的治療作用。Qian等（2015）研究得出，銀杏黃酮能阻止核內調控蛋白的表達從而阻遏胃癌因子生長的信號通路。

2.4 抗纖維化作用 銀杏葉黃酮對纖維的形成有抑制作用，可保護內部組織器官。異鼠李素是銀杏葉中含有的一種黃酮醇類物質，白跳等（2018）研究發現，異鼠李素對肝纖維化糖尿病大鼠的纖維化過程有一定的干預抑制作用，并且可有效地通過抑制大鼠心肌TGF-β/Smad通路來治療心肌纖維性硬化等纖維化疾病。何明等（2005）進行臨床觀察和試驗得出，以銀杏黃酮甙的聯合用藥可以治療肺間質纖維化，其治病機理有可能與影響體內免疫細胞因子有關。曹雯等（2015）研究了以3種黃酮甙聯合用藥對肝纖維化大鼠的臨床治療效果及作用機制，結論分析得出，銀杏黃酮類活性物質能有效地對抗CCl4誘導的肝臟組織纖維化，并對大鼠肝臟功能起到一定的保護作用。

3 銀杏葉黃酮的提取和純化工藝

3.1 銀杏葉黃酮的提取工藝

3.1.1 有機溶劑提取法 有機溶劑提取法是最為傳統也是目前使用最普遍的一種方法，一般使用乙醇、甲醇等有機溶劑進行提取，在國內主要采用乙醇回流提取。宋靜靜等（2015）優化了銀杏葉黃酮的提取工藝，得出在乙醇濃度50%，固液比1:45，提取時間2 h，溫度70℃的提取條件下，銀杏葉黃酮提取率可以達到最高。邵京等（2013）通過正交試驗得出了有機溶劑提取銀杏葉黃酮的最佳工藝方式，當料液比1:20，提取溫度90℃，乙醇濃度50%，提取時間6 h時，黃酮含量最高約占提取物的35%。

3.1.2 微波輔助提取法 近幾年微波輔助提取法萃取黃酮類物質也漸漸興起。其主要原理是在微波高溫環境下使細胞破裂，細胞內有效成分自由流出后利用各物質介電常數的不同，使不同組分以不同速度再分離 （羅泰然，2018）。徐春明等（2014）得出，微波輔助乙醇法提取銀杏黃酮的優化條件：在固液比 1:25（mL:g），微波功率 300 W的條件下，用體積分數為70%乙醇微波提取60 s，總黃酮的提取得率可達到2.690%。梁曉峰（2012）研究顯示，與乙醇溶劑萃取相比，微波輔助提取可將銀杏黃酮的收率提高1.64倍。

3.1.3 超聲波提取法 超聲波提取是近年來發展的新型提取黃酮類物質的方法，原理是利用強烈空化效應，強烈地攪拌、振動等所產生的機械效應，加速含黃酮植物的細胞壁和細胞膜裂解，導致黃酮高速脫離植株并高效溶解于溶劑中。此法所用儀器簡便，自動化程度高，可適用于工廠大規模生產。于德涵等（2020）采用響應面法優化超聲波提取銀杏葉總黃酮的提取工藝，得出在50℃提取溫度下，用63%的乙醇提取32 min后，銀杏葉中黃酮提取率可高達5.328%。

3.1.4 酶解輔助提取法 銀杏葉細胞壁主要由纖維素等聚合的高分子化合物構成，銀杏葉黃酮不易流出。酶解輔助提取法的原理主要是利用纖維素酶能降解植物細胞壁骨架結構，使細胞破裂后黃酮類物質釋放到溶劑中再進行提取。酶解法具有針對性強、安全性好、提取條件溫和、工藝簡單可行等優點。石會軍等（2014）進一步優化了纖維素酶法提取銀杏葉總黃酮的工藝條件，得出浸提液pH 5.2和酶解溫度為80℃的條件下，用0.90%纖維素酶酶解60 min，提取率最高為3.452%。張偉等（2014）研究傳統提取和纖維素酶輔助劑提取銀杏葉黃酮的效果發現，添加纖維素酶后銀杏葉黃酮得率提高了45.8%。

3.1.5 超臨界流體萃取法 該萃取的方法主要是通過利用在特定環境下超臨界流體的黏度較低、擴散系數大、溶解性和傳質性能良好的特點，通過調節流體壓力和溫度的方式來選擇性地從固體或液體中萃取某一組分，之后再通過使這些超臨界的流體變成惰性的氣體從而與超臨界的產物進行分離 （楊小青等，2014）。超臨界流體可以循環使用，具有能耗低、天然活性成分不易破壞、安全性高等優點，但成本投入比較大，目前超臨界二氧化碳作為萃取流體應用最多。趙琦君等（2009）研究顯示，當加入90%乙醇作夾帶劑，在溫度50℃，壓力35 MPa的條件下超臨界萃取1.5 h，總黃酮提取率達到最大。

3.2 銀杏葉黃酮的純化方法

3.2.1 膜分離法 膜分離法是以半透膜作為介質，通過控制半透膜上的孔徑大小，從分子水平對混合液中的物質進行選擇性分離。半透膜按孔徑大小可以分為RO、NF、UF、MF等。膜分離法具有工藝簡單方便、低能環保、成本低廉等優點。向文藝等（2012）在研究膜分離法提取銀杏葉黃酮時，使用透過性分子質量為10000的半透膜，在壓力為0.30 MPa，純化溫度為30℃的工藝下純化時，黃酮透過率高達72%。徐秋燕等（2015）利用超濾法提取銀杏葉黃酮發現，在乙醇濃度為25%，超濾溫度為30℃，超濾壓力為0.9 MPa時，提取物中的黃酮含量可達4.83%。

3.2.2 大孔吸附樹脂法 大孔吸附樹脂純化主要原理是通過樹脂的吸附能力對有效成分進行物理吸附。不同吸附樹脂的型號、孔道大小和比表面積可對溶液中的有機物進行篩選。樹脂純化方法具有穩定性良好、使用周期長、吸附量大和可循環使用等特點。楊文婷等（2014）用D101樹脂純化銀杏葉的總黃酮，當上樣液濃度為2.0 mg/mL，洗脫劑為80%的乙醇，洗脫上柱流速為2 BV/h時，總黃酮的含量最高可達44.2%。李鳳艷等（2018）研究了LX-68型樹脂純化銀杏葉黃酮的工藝，得出當提取溶劑pH為4，流柱速度為2 BV/h，最后用70%乙醇洗脫時，提取物中總黃酮含量達27.30%。

3.2.3 聚酰胺柱層析法 聚酰胺柱層析法的基本原理是利用聚酰胺的酰胺基與黃酮類化合物的酚羥基之間作用形成氫鍵來對黃酮進行吸附和分離。尹秀蓮等（2007）用聚酰胺樹脂純化法，研究了不同濃度乙醇洗脫對純度的影響，得出每克聚酰胺粉平均吸附量為115 mg/g，用70%乙醇洗脫后，總黃酮的純度為15.6%。

4 銀杏葉黃酮抗氧化性及抑菌性研究

4.1 銀杏葉黃酮的抗氧化性 銀杏葉黃酮化合物是天然植物中的抗氧化劑，可以有效清除機體內各種自由基，如超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基，能夠提高體內超氧化物歧化酶的活性，并有效地消除人體內氧化生成的各種不飽和脂類自由基、蛋白質自由基，避免人體細胞和組織受到氧化損傷。其作用機理在于：（1）黃酮類物質供氫能力強，可結合自由基離子，從而切斷自由基連鎖反應鏈而將其直接清除；（2）黃酮物質與金屬離子鰲合使自由基無法生成；（3）保護和還原體內的維生素C等還原劑，還能起到協同抗氧化的作用（呂娜，2014）。 張光輝等（2018）將1 mL的銀杏黃酮中加2 mL DPPH自由基溶液，抗自由基活性最高可達68.90%。李敏等（2013）發現，銀杏葉黃酮對三種自由基的清除力度隨著黃酮添加量的增大而加強，且清除能力高于同濃度的維生素C溶液。

4.2 銀杏葉黃酮的抑菌性 黃酮類化合物能使細菌蛋白質凝固或變性，主要原理是黃酮類化合物結構中含酚羥基團，使pH呈弱酸性，并且其作為酚類物質的衍生物還可破壞細菌細胞壁和細胞膜骨架，細胞內成分被釋放出來，從而使微生物的生長受限（陳叢瑾等，2011）。隨著當今社會抗生素的大量濫用，細菌的耐藥性也越來越強，銀杏葉黃酮具備作為一種純天然的食品防腐劑的潛力，當其與其他天然防腐劑或人工防腐劑混合使用時，抗菌防腐效果更佳。胡筱等（2014）通過抑菌圈試驗研究得出，銀杏黃酮對大多數菌類都有抑制功效，但對食品中菌類的抑制效果由食品的性質與狀態決定。豁銀強等（2012）采用濾紙片法進行抑菌試驗，得出銀杏葉黃酮溶液對微生物的抑菌效果細菌>霉菌>酵母菌。黃其春等（2012）發現，銀杏葉黃酮對動物腸道中的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產氣腸桿菌和銅綠假單胞菌等有害菌群，都表現出很好的抑制效果。

5 銀杏葉黃酮在飼料中的應用

隨著禽畜養殖業的不斷發展，人們對禽畜產品的要求也越來越高，既要達到營養需求，又要保證產品安全衛生、無副作用。銀杏樹資源在我國儲量豐富，并且銀杏葉黃酮化合物無耐藥性、無免疫抑制，具有營養、藥理雙重效果，可作為添加劑添加到動物飼料中。

銀杏葉提取物中的有效成分黃酮能抑制病原微生物的生長，維持動物腸道環境穩態，提高生殖能力和抗病能力，還能預防腫瘤等疾病發生，對家畜、家禽的健康有促進作用。陳強等（2013）在雞飼料中添加銀杏葉提取物發現，平均日增質量顯著高于其他肉雞，并且肉雞的抗氧化性能顯著提高，其血清中丙二醛含量顯著降低，而血清球蛋白的含量和超氧化物歧化酶的活力顯著提高。任小杰等（2018）通過研究日糧中添加不同劑量銀杏葉提取物對肉雛雞生產性能及血清蛋白水平的影響發現，肉雞血清中高密度脂蛋白的含量顯著升高，低密度脂蛋白、甘油三酯、膽固醇等物質含量下降，從而改善肉質的食用品質。另外，黃酮可以作用于動物生長軸上的有關受體，刺激動物體內分泌內生長激素，促進機體加快生長（許嘯和齊智利，2012）。曹福亮等（2006）將發酵后的銀杏葉作為飼料添加劑喂食黃羽肉仔雞，一段時間后檢測肉雞的生長情況發現，銀杏葉發酵產物對黃羽肉仔雞生長有顯著的促進作用，平均日增重比對照組提高5.74%。

近年來飼料行業研究的熱點逐漸轉向微生物與銀杏葉混合制備發酵飼料。一方面，銀杏葉中的活性物質被微生物的生長和代謝利用，可促進微生物合成更多活性物質如維生素、氨基酸、蛋白酶等。另一方面，銀杏葉在微生物體內酶的催化下進行深度加工，能將銀杏酸等有毒物質分解與轉化。因此制備銀杏葉發酵飼料具有理論和現實意義。銀杏葉黃酮作為飼料添加劑功能多樣，有經濟綠色、無毒副作用、來源天然等多種優點，既能增強機體免疫，抑菌抗病毒，又有加快動物生長速度，提高肉質品質等功效，順應了環保的大趨勢而極具市場競爭力，可以作為一種安全綠色的多功能添加劑廣泛應用于多種飼料工業和動物生產中，有廣闊的發展前景。