灌漿初期高溫影響水稻籽粒碳氮代謝的機理*

王軍可，王亞梁，陳惠哲，向 鏡，張義凱，朱德峰，張玉屏

（中國水稻研究所/水稻生物學國家重點實驗室，杭州 311400）

氣候變暖導致全球溫度升高是近年來氣候變化的明顯特征[1]，隨著全球氣溫升高，水稻高溫熱害頻發，尤其南方水稻在灌漿期遇到高溫已成為制約稻米品質的重要因素。水稻灌漿結實期最適平均溫度為21℃左右，35℃以上高溫則會顯著降低稻米的產量和品質[2-3]，籽粒碳氮代謝的生理過程對籽粒灌漿起著關鍵作用。作為籽粒干重的重要組分，淀粉和蛋白質的代謝受碳氮代謝生理過程影響[4?5]。

高溫影響籽粒碳氮代謝，淀粉合成受阻及堊白含量顯著增加是高溫影響稻米品質的顯著特征[6?7]。作為葉片光合產物向各器官運輸的主要形式，蔗糖是籽粒中淀粉合成的主要碳前體，蔗糖轉運體（SUTs）在通過質外體途徑轉運蔗糖的過程中起重要作用[8?9]。高溫影響蔗糖代謝過程，Zhong等[10]研究指出，32℃以上高溫導致稻米食味和加工品質下降與高溫抑制淀粉和蔗糖代謝存在關系，Zhang等的[11]研究指出，高溫通過破壞韌皮部胞間連絲而抑制蔗糖轉運。陳燕華等[12]在穗發育的研究中指出，40℃高溫顯著降低蔗糖轉運蛋白相關基因的表達，然而高溫對籽粒中蔗糖轉運基因表達的影響需進一步研究。淀粉的進一步合成依賴于ATP與各種酶促反應的協調進行，高溫降低淀粉合成關鍵酶（ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶、顆粒結合型淀粉合成酶及去分支酶活性）活性導致淀粉合成降低已成為基本共識[13?14]，而對籽粒中能量代謝與淀粉合成關系的研究相對較少。糖酵解和三羧酸循環是主要的產能途徑，α-酮戊二酸作為三羧酸循環重要的中間產物，也參與氮代謝中谷氨酸的合成，研究表明[15]，高溫抑制了穗發育過程中糖酵解和三羧酸循環過程中關鍵酶的活性，而在籽粒中這種現象是否存在并不清楚。高溫促進蛋白質的合成[16]，但高溫下氮代謝與三羧酸循環的關系并不清楚。轉錄組分析表明，灌漿期高溫影響表達的基因包括抑制蔗糖水解和淀粉合成，同時促進淀粉水解和儲藏蛋白質合成[17?18]。然而蛋白質和淀粉是否受到統一途徑代謝的影響并不清楚。為此，本研究擬以長江中下游優質粳稻浙禾香2號為材料，選擇水稻種子發育5、10及15d這3個時期，在常溫和高溫處理下，通過籽粒發育過程中淀粉和蛋白積累的變化，分析蔗糖轉運及分解、糖酵解及三羧酸循環關鍵酶活性、淀粉代謝關鍵酶活性以及氮代謝關鍵酶活性，以期深化籽粒灌漿期高溫熱害理論，明確高溫對碳氮代謝的影響，并為稻米品質的調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗供試品種為嘉興市農業科學院選育的優質稻品種浙禾香2號，于2019年在中國水稻研究所富陽試驗基地進行盆栽試驗，塑料種植盆規格為24cm×22.5cm×21.5cm，每盆裝過篩土8kg。5月25日播種，大棚基質育秧，6月15日選取生長狀況一致的秧苗進行移栽，每盆2穴，每穴2苗，共120盆。每盆施復合肥（N∶P∶K=15%∶15%∶15%）4.0g作基肥，而后施0.5g尿素作分蘗肥，穗分化始期施2.25g復合肥作穗肥，水稻生長期間其它管理措施與高產栽培一致。

1.2 溫度處理及籽粒樣本采集

設置適溫（NT）和高溫（HT）兩個處理，均在人工氣候箱（PGV-36型CONVIRON）內進行，具體溫度設置如表1。人工氣候箱具有自動控溫控濕的功能，氣候箱透光面所用材質為超透明的超白鋼化玻璃，具有低自爆率、顏色一致、可見光透過率高及通透性好等特點，其光照以外界自然光為主，光譜損失少，基本保持箱內光照與外界自然光照一致，同時人工氣候箱底部有鼓風裝置，以此保證二氧化碳濃度與室外基本一致。箱內環境條件能達到試驗處理要求。在水稻灌漿始期當天正午移入氣候箱開始進行高溫和適溫處理，共持續15d，結束后移至自然環境下生長至成熟，收獲時間為10月21日。

移入氣候箱后選擇大小基本一致的單穗掛牌標記，每處理標記80穗，供取樣分析。溫度處理期間，分別于5d（第6天）、10d（第11天）、15d（第16天）和成熟收獲時，各取稻穗20個，將穗子按長度三等分，留取穗中部籽粒作為樣本，用鋁箔紙包裹，經液氮冷凍后，裝入自封袋，置于?80℃冰箱保存，然后統一測定。

表1 人工氣候箱溫度設置Table 1 Temperature setting of different treatments in climate chamber

1.3 項目測定

1.3.1 粒重

在每次收集的籽粒樣本中，各取大小均勻的籽粒50顆去殼，置于電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9070A）中105℃殺青30min，80℃烘至恒重，后用德國sartoriys BS 224S電子天平測定粒重，算術平均計算單粒重。

1.3.2 蔗糖代謝關鍵酶活性及相關代謝物含量

在每次收集的籽粒樣本中，各取大小均勻的冷凍去殼籽粒0.1g檢測。蔗糖含量測定采用蒽酮比色法[19]，葡萄糖和果糖含量、可溶性酸性轉化酶和蔗糖合酶活性利用蘇州某公司提供試劑盒進行測定，重復3次，取平均值。

1.3.3 能量代謝關鍵酶活性及相關代謝物含量

在每次收集的籽粒樣本中，各取大小均勻的0.1g冷凍籽粒，利用己糖激酶、丙酮酸激酶、檸檬酸合酶、異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、琥玻酸脫氫酶及蘋果酸脫氫酶活性試劑盒進行測定，利用ATP和ADP含量測定試劑盒進行含量測定，試劑盒由蘇州某公司提供，重復3次，取平均值。

1.3.4 淀粉代謝關鍵酶活性及相關代謝物含量

在每次收集的籽粒樣本中，各取大小均勻的0.1g冷凍籽粒。腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）含量采用雙抗體夾心法利用ELISA試劑盒測定，測定原理為，用純化的植物腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入植物腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG），再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體?抗原?酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中植物腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）含量。利用腺苷二磷酸葡萄萄糖焦磷酸化酶（AGP）、顆粒結合型淀粉合成酶、可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶及淀粉磷酸化酶活性測定試劑盒（蘇州某公司提供）進行測定。淀粉含量測定參考Hansen等[20]的方法。各指標測定均3次重復，取平均值。

1.3.5 氮代謝關鍵酶活性及相關代謝物含量

全氮含量測定：在每次收集的籽粒樣本中，各取烘干后的籽粒0.2g，通過全自動樣品快速研磨儀（Tissuelyser-48，上海）磨成細粉，采用H2SO4- H2O2消煮，并用FOSS全自動凱氏定氮儀測定含氮量。

蛋白質含量測定：參考GB 5009.5-2016食品安全國家標準食品中蛋白質的測定方法。

其它氮代謝相關指標測定：選取0.1g冷凍籽粒。利用氨基酸含量、α-酮戊二酸含量、亞硝酸還原酶活性、硝酸還原酶活性、谷氨酰胺合成酶活性及谷氨酸合酶活性試劑盒進行相關指標含量和活性的測定。各指標測定均3次重復，取平均值。

1.3.6 籽粒RNA提取和實時熒光定量

取冷凍保存的籽粒樣品0.1g，用于蔗糖轉運蛋白相關基因OsSUT1和OsSUT2相關表達量的測定。籽粒總RNA參照Trizol法[21]提取，利用TOYOBO的Rever Tra Ace quantitative PCR RT Master Mix（Toyobo， Osaka， Japan）試劑盒反轉錄。熒光定量PCR所采用的設備為7500 Real Time PCR System（Applied Biosystems System）。反轉錄后的產物稀釋后作為模板cDNA。用內參基因OsUBQ引物檢測反轉錄產物，引物采用Primer5軟件設計，基因表達分析所用引物序列如表2所示；根據樣品特定熒光閾值的Ct值，采用2?ΔΔCt法[22]計算不同樣品間基因的相對表達量。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Primers used for quantitative real-time PCR

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel統計數據，用SAS9.1軟件進行數據分析，處理間的差異分析采用student單尾t檢驗法。

2 結果與分析

2.1 高溫對籽粒重及其淀粉/蛋白質含量的影響

圖1 灌漿初期高溫（HT）與適溫（NT）處理持續5d、10d和15d后采樣以及成熟時采樣觀測的籽粒重及其淀粉/蛋白質含量的比較Fig.1 Comparison of grain weight and its starch/protein content sampled after 5d， 10d and 15d treatment， during the early stage of filling and maturity stage between high temperature（HT）and normal temperature（NT）

由圖1可知，高溫抑制水稻籽粒干物質積累，但對淀粉和蛋白質積累的影響存在差異。高溫處理15d導致成熟期籽粒粒重降低16.9%，處理期間高溫下淀粉相對含量降低，蛋白質相對含量卻呈現上升的趨勢。

2.2 高溫對籽粒碳代謝的影響

2.2.1 對蔗糖轉運的影響

蔗糖是籽粒中淀粉積累的重要來源，蔗糖的轉運與卸載對淀粉合成有重要意義，作為蔗糖轉運家族的重要成員，OsSUT1和OsSUT2在籽粒灌漿過程中起著重要作用；葡萄糖和尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）是籽粒中淀粉合成的基礎物質，其來源于光合產物蔗糖的分解。

由圖2可見，與適溫（31℃/24℃）條件下相比，灌漿初期高溫（35℃/28℃）持續5d、10d和15d后，籽粒中蔗糖轉運基因OsSUT1（圖2a）和OsSUT2（圖2b）的相對表達量均極顯著降低，而且高溫處理超過10d后，OsSUT2的相對表達量下降更多，從而造成高溫處理5d、10d和15d后籽粒中蔗糖含量極顯著低于同時段適溫條件下（圖2c）。可見，灌漿初期高溫使籽粒發育過程中蔗糖供應受到明顯抑制。

而由圖3可見，高溫條件下持續5d和10d處理中，籽粒中可溶性酸性轉化酶活性（S-AI）（圖3a）和蔗糖合成酶（SS-I）活性（圖3b）極顯著高于適溫處理（P＜0.01），持續15d后該兩種酶的活性明顯下降，與適溫處理一致或明顯降低。SS-I主要催化蔗糖和UDP生成游離果糖和UDPG，而S-AI催化蔗糖不可逆地分解為葡萄糖和果糖，由圖3c、圖3d可見，高溫條件下持續5d和10d處理中籽粒中果糖含量明顯高于適溫處理，持續15d后果糖含量與適溫處理差異不顯著；而高溫條件下各處理時段籽粒中葡萄糖含量均明顯高于適溫處理。可見，灌漿初期高溫使籽粒發育過程中S-AI和SS-I活性增加，加速了蔗糖向UDPG和葡萄糖的轉化。

2.2.2 對淀粉代謝的影響

蔗糖的分解產物在淀粉體中經ADPG焦磷酸化酶（AGPase）催化形成淀粉的直接合成前體腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG），后經顆粒結合淀粉合成酶（GBSS）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、淀粉分支酶（SBE）、淀粉去分支酶（DBE）等一系列酶的作用下分別合成直鏈淀粉和支鏈淀粉。

由圖4可見，隨著高溫處理時間的延長，AGPase活性降低，而ADPG含量卻呈現上升的趨勢，同時GBSS和SSS活性顯著下降，說明直鏈淀粉合成受阻。同時隨著處理時間的延長，SBE活性先升高后降低，DBE活性呈現先下降后上升的趨勢。說明灌漿前期15d高溫對淀粉合成的影響主要通過降低AGPase、GBSS、SSS和SBE的活性以及前10d的DBE的活性來降低淀粉的合成，高溫處理下ADPG含量上升的原因是其進一步合成淀粉的途徑受阻。

圖2 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒蔗糖轉運基因表達量（a、b）和蔗糖含量（c）的比較Fig.2 Comparison of the expression of sucrose transporter genes（a，b） and sucrose content（c） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

圖3 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒可溶性酸性轉化酶活性（a）、蔗糖合成酶活性（b）、果糖含量（c）以及葡萄糖含量（d）的比較Fig.3 Comparison of soluble acid invertase activity（a）， sucrose synthase activity（b）， fructose content（c） and glucose content（d） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

圖4 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒AGPase（a）、GBSS（b）、SSS（c）、SBE（d）、DBE活性（e）及ADP-葡萄糖含量（f）的比較Fig.4 Comparison of the activity of AGPase（a）， GBSS（b）， SSS（c）， SBE（d）， DBE（e） and the ADPG（f） content in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

淀粉合成的同時也在不斷地被利用，α-淀粉酶、β-淀粉酶和淀粉磷酸化酶是主要的淀粉降解酶。由圖5可見，與適溫處理相比，隨著高溫處理時間的延長，ɑ-淀粉酶，β-淀粉酶及淀粉磷酸化酶活性呈上升的趨勢，說明高溫促進了籽粒淀粉水解。

可見，灌漿初期高溫使籽粒發育過程中淀粉合成減少，而淀粉的水解增強，最終導致淀粉含量的降低。

2.3 高溫對水稻籽粒糖酵解及三羧酸循環關鍵酶活性的影響

ATP參與ADPG和淀粉的合成，淀粉體中ATP的含量與ADPG和淀粉含量呈正相關[23]，糖酵解及三羧酸循環是主要的產能過程。對不同溫度處理下籽粒中糖酵解及三羧酸循環關鍵酶的分析可知，高溫下糖酵解關鍵酶活性受到抑制，隨著處理時間的延長，己糖激酶和丙酮酸激酶活性顯著下降（圖6），說明糖利用受阻。由圖7可見，三羧酸循環關鍵酶活性的變化在高溫下表現出明顯的差異，檸檬酸合酶、α-酮戊二酸脫氫酶及琥珀酸脫氫酶活性顯著下降，而隨著處理時間的延長，異檸檬酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶活性顯著升高。高溫下ATP和ADP總量與適溫下并無顯著差異。

可見，灌漿初期高溫致使能量代謝紊亂，最終導致高溫下ATP和ADP總量與適溫下并無顯著差異。

圖5 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒α-淀粉酶（a）、β-淀粉酶（b）以及淀粉磷酸化酶（c）活性的比較Fig.5 Comparison of the activity of α-amylase（a）， β-amylase（b） and starch phosphorylase（c） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

圖6 高溫（HT）與適溫（NT）處理己糖激酶活性（a）和丙酮酸激酶（b）活性的比較Fig.6 Comparison of the activity of hexokinase（a） and pyruvate kinaset（b） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

圖7 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒三羧酸循環關鍵酶活性（a?e）及ATP和ADP含量總和（f）的比較Fig.7 Comparison of the activity of key enzymes in the tricarboxylic acid cycle（a-e），sum of ATP and ADP content（f） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

2.4 高溫對水稻籽粒氮代謝的影響

硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）是氮素同化過程中的關鍵酶，其活性顯著影響著蛋白質含量。α-酮戊二酸是三羧酸循環過程的中間產物，也是氮代謝中形成谷氨酸的重要原料，谷氨酸則可轉化成其它氨基酸和酰胺進而形成蛋白質。

由圖8可見，隨著高溫處理時間的延長，籽粒總氮含量較常溫處理有上升趨勢，但差異未達顯著水平。α-酮戊二酸含量顯著增加，使谷氨酸的合成原料增加。同時谷氨酸和氨基酸含量在高溫處理下顯著提高。圖9顯示，與適溫處理相比，隨著高溫處理時間的延長，硝酸還原酶和亞硝酸還原酶活性呈現下降的趨勢，使谷氨酸的另一合成原料氨減少，而高溫下谷氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶活性與適溫相比差異不明顯。可見，灌漿初期高溫使籽粒發育過程中異檸檬酸脫氫酶活性增加和α-酮戊二酸活性的降低，加速了α-酮戊二酸的積累，促進了α-酮戊二酸向谷氨酸的轉換，加速了籽粒中形成蛋白質的原料即氨基酸含量的增加，進而導致蛋白質含量升高。

3 討論與結論

本實驗條件下，高溫抑制水稻籽粒發育，導致干物質積累顯著下降。試驗表明，隨著高溫處理時間的延長，淀粉含量顯著下降，而蛋白質含量顯著上升，導致稻米品質變差，這與前人的研究結論是一致的[24?25]。但高溫下淀粉和蛋白質的絕對含量低于適溫處理，說明高溫對籽粒的物質代謝造成影響。碳代謝方面，籽粒干物質積累主要來源于光合作用的蔗糖供應，試驗發現，高溫下蔗糖轉運表達基因OsSUT1和OsSUT2表達量下調，說明轉運卸載到籽粒中的蔗糖受到抑制，Zhang等[11]研究表明，高溫下籽粒干物質積累受阻的主要原因是蔗糖分解受阻，而在本研究中，隨著處理時間的延長，與適溫相比，可溶性酸性轉化酶和蔗糖合成酶在高溫下呈現先上升后下降的趨勢，可見蔗糖分解受阻并不是干物質積累降低的主要原因。與前人研究結果的差異可能是由于設置處理溫度不同導致，不同溫度條件下，蔗糖轉運和卸載對籽粒干物質積累的影響程度有待進一步明確。

圖8 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒全氮（a）、α-酮戊二酸（b）、谷氨酸（c）和氨基酸（d）含量的比較Fig.8 Comparison of the content of total nitrogen（a）， ɑ-Ketoglutarate（b）， glutamate（c）and amino acid（d） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT） treatments

圖9 高溫（HT）與適溫（NT）處理籽粒硝酸還原酶（a）、亞硝酸還原酶（b）、谷氨酰胺合成酶（c）及谷氨酸合酶（d）活性的比較Fig.9 Comparison of the activities of nitrate reductase （a）， nitrite reductase （b）， glutamine synthetase （c） and glutamate synthase （d） in grains treated with high temperature （HT） and normal temperature （NT）

高溫下葡萄糖和果糖含量有所上升，對糖酵解關鍵酶己糖激酶和丙酮酸激酶活性進行分析發現， 高溫下兩種酶活性均呈顯著下降趨勢，說明糖利用受阻。另一方面，試驗發現，高溫導致淀粉水解酶活性增加，這也是葡萄糖和果糖含量增加的原因之一，研究表明淀粉水解導致可溶性糖積累可以提高籽粒的抗氧化能力[26?27]。能量代謝方面，本實驗中三羧酸循環過程關鍵酶活性在高溫下的變化不一致，可能是由反饋調節導致，作為三羧酸循環重要的中間產物，α-酮戊二酸的代謝與蛋白質合成密切相關，異檸檬酸脫氫酶活性上升促進了α-酮戊二酸的合成，同時α-酮戊二酸脫氫酶活性受到抑制減少了α-酮戊二酸的利用，進一步提高了α-酮戊二酸含量。雖然高溫導致三羧酸循環代謝紊亂，但ATP和ADP含量在高溫下并沒有發生顯著變化，說明能量供應并未受阻，α-酮戊二酸含量的增加也進一步促進氮代謝谷氨酸形成。氮代謝方面，高溫下氮代謝相關酶活性受高溫的影響較淀粉代謝相關酶活性受高溫的影響小，高溫下谷氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶活性受高溫影響不大，與梁成剛等[28]的結果有所差異，原因可能是不同遺傳背景材料的氮代謝過程對溫度的響應不同。試驗表明，α-酮戊二酸含量增加是蛋白質相對量積累提高的原因之一。試驗中，與適溫處理相比，高溫下氨基酸積累顯著增加，一方面與氨基酸合成增加有關，另一方面，可能由于高溫促進了氨基酸向籽粒的轉運，試驗發現高溫下銨態氮和硝態氮轉運相關基因表達量較低，更詳細的氨基酸轉運途徑有待于進一步研究。

綜上所述，高溫主要通過阻礙蔗糖轉運抑制籽粒發育，同時高溫導致糖酵解和三羧酸循環紊亂；高溫下籽粒淀粉含量下降的主要原因是淀粉合成受阻且淀粉水解增強；高溫會導致三羧酸循環過程紊亂，α-酮戊二酸積累增加是蛋白質含量上升的原因之一。α-酮戊二酸參與的能量代謝的相關研究可為高溫下稻米品質的改良提供新思路，α-酮戊二酸能否作為外源調節劑減弱灌漿前期高溫對水稻生產的影響，還有待進一步研究。