針刺對腦卒中大鼠炎癥損傷及miR-214的影響

李春琴，鄧寒冰，張粲，金祖敏

腦卒中具有高病死率、高致殘率的特點，患者易出現認知功能障礙致生存質量較差［1］。腦卒中患者腦梗死區免疫細胞特別是中性粒細胞可通過受損血腦屏障移至受損部位，促進促炎因子生成，進而發揮免疫防御作用；促炎因子分泌過剩可誘導免疫級聯放大反應，導致氧化應激等反應發生，影響細胞功能，從而使疾病加重［2］。因此，減輕腦組織中炎癥反應對于治療腦卒中意義重大。研究顯示，持續對腦出血大鼠行針刺治療可減輕其炎癥反應，但具體機制尚不清楚［3］。微小RNA（microRNA，miRNA）在細胞增殖、細胞分化、炎癥反應及組織纖維化等方面發揮重要作用，可影響疾病進程。研究顯示，miR-214可通過調控第10 號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失的基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）及白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達，影響卒中進展［4-5］。針刺是否可影響miR-214及其下游信號通路水平，從而影響疾病進展尚不清楚。因此，本研究建立大鼠腦卒中模型，探究針刺陽陵泉、曲池穴位對腦卒中大鼠炎癥損傷的影響，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色試劑盒、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA 第一條鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量檢測試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；兔源PTEN、絲蘇氨酸蛋白激酶（threonine protein kinase，AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、IL-6、內參GAPDH、LaminB 一抗以及羊抗兔二抗（英國abcam 公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；康嶺G91-E電針儀（揚州康嶺醫用電子儀器有限公司）；實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）儀7500（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 實驗動物 48只SPF級、45日齡的SD大鼠，雌雄不限，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2017-0033；體質量200～220 g，動物實驗中心溫度（25±1）℃、濕度（55±5）%、12 h/12 h（光照/黑暗）飼養。本實驗經本院倫理委員會審核通過。

1.3 動物模型建立與分組 以隨機數字表法抽取36 只大鼠，參照文獻［6］以改良Longa 線栓法建立大鼠腦卒中模型，左頸部去鼠毛、消毒，分離出左側頸總動脈、頸外動脈并結扎；分離頸動脈，于頸內動脈與頸外動脈分叉膨大處切口，尼龍線插入頸內動脈切口端并與頸內動脈一起結扎。術后2 h Longa評分法驗證模型情況，36只大鼠卒中模型均成功，以隨機數字表法分為模型組、針刺組、陽性對照組，每組12只。余12只大鼠設為假手術組，僅分離頸總動脈，不結扎、不切口、不插線，其余步驟與大鼠腦卒中建立模型相同。

1.4 模型處理 參照文獻［7］中動物針灸穴位圖譜并結合解剖學方法，根據穴位走向，針刺組大鼠針刺陽陵泉（雙）、曲池（雙），1 次/d，每次留針30 min，留針期間每10 min 行針1 次（頻率：80次/min；捻轉角度：180°；持續時間：1 min）。陽性對照組采用0.4 mg/kg 尼莫地平溶于1 mL 生理鹽水中灌胃［8］，1次/d，7 d為1個療程，連續2個療程。假手術組針刺非穴位處作為對照，假手術組和模型組灌胃等體積生理鹽水，均干預14 d。

1.5 Longa評分評價大鼠行為學情況 5分制神經功能缺失評分：無神經功能癥狀為0 分，不能完全伸展對側前爪為1分，爬行時偏癱側旋轉為2 分，行走時對側傾倒3 分，不能自發行走為4分，死亡為5分。

1.6 TTC 染色檢測大鼠腦梗死體積 每組大鼠以隨機數字表法抽取4 只取全腦組織置于-20 ℃冰箱中冷凍25 min，腦組織橫切成6 片，0.1%TTC 溶液中37 ℃孵育15 min，10%福爾馬林室溫固定1 h，拍照并用Image-J v1.8.0 軟件分析梗死百分比。梗死區呈白色，正常腦組織呈紅色。腦梗死體積（%）=白色體積/總體積×100%。其余8只部分大腦冠狀部置于4%多聚甲醛中固定，用于HE 染色，其余置于-80 ℃冰箱備用。

1.7 HE染色觀察大鼠大腦冠狀部情況 每組另外8只部分經4%多聚甲醛中固定過夜后的大腦冠狀部，制備6 μm厚度常規石蠟切片，按HE染色試劑盒步驟對切片染色，中性樹膠封片，顯微鏡（×200）拍照觀察大腦冠狀部情況。部分大腦冠狀部行qPCR和蛋白免疫印跡實驗。

1.8 qPCR檢測大腦冠狀部miR-214相對表達水平 部分大腦冠狀部研磨充分，miRNA 提取試劑盒提取miRNA，miRNA cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA。miR-214引物：上游5′-ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3′，下 游5′-TTAGCCCGCTCAACACT-3′；U6引物：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應體系20 μL：cDNA（50 ng/μL）1 μL、2×Hi SYBR Green QPCR Mix 10 μL、上游/下游引物（10 μmol/L）1 μL、ddH2O 8.0 μL。反應條件：94 ℃90 s；95 ℃32 s，61 ℃35 s，45 個循環；72 ℃10 min。2-ΔΔCt法對大腦冠狀部中miR-214表達水平進行定量分析。

1.9 蛋白免疫印跡檢測大鼠大腦冠狀部PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6 蛋白表達情況 各組取部分大腦冠狀部充分研磨，取部分采用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用于檢測PTEN、AKT、p-AKT、IL-6、GAPDH；其余部分采用相應試劑盒提取組織細胞漿和細胞核中蛋白用于檢測細胞漿中NF-κB 以及細胞核中NF-κB、LaminB。蛋白定量后行SDSPAGE 電泳、轉膜，封閉后加入對應一抗4 ℃過夜孵育；加入對應二抗，室溫孵育1 h，顯色后拍照片并用Image-J v1.8.0分析灰度值。蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/對應內參灰度值。

1.10 統計學方法 采用GraphPad 8.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，組內處理前后比較采用配對t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠Longa評分比較 （1）組間比較。建模后處理前，與假手術組比較，模型組、針刺組、陽性對照組Longa 評分升高（P＜0.05），而后3 組間差異無統計學意義（P＞0.05）。處理結束后，與假手術組比較，模型組、針刺組、陽性對照組Longa 評分升高（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組、陽性對照組Longa評分降低（P＜0.05）。（2）組內比較。與建模后處理前比較，處理結束后針刺組、陽性對照組Longa評分降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of Longa scores of rats between the four groups表1 4組大鼠處理前后Longa評分比較（n=12，分，±s）

Tab.1 Comparison of Longa scores of rats between the four groups表1 4組大鼠處理前后Longa評分比較（n=12，分，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與假手術組比較，b 與模型組比較，P＜0.05；針刺組與陽性對照組不做比較

組別假手術組模型組針刺組陽性對照組F建模后處理前0.00±0.00 2.47±0.28a 2.52±0.31a 2.50±0.34a 257.912＊＊處理結束后0.00±0.00 2.79±0.34a 1.17±0.34ab 1.43±0.28ab 203.353＊＊t 0.000 1.861 2.753＊8.510＊＊

2.2 各組腦梗死體積比較 假手術組、模型組、針刺組及陽性對照組的腦梗死體積分別占（0.00±0.00）%、（31.46±4.16）%、（16.35±3.14）%、（25.34±3.63）%（n=4，F=74.224，P＜0.05），其中與假手術組比較，模型組、針刺組、陽性對照組腦梗死體積均增大（P＜0.05）；與模型組相比，針刺組腦梗死體積減小（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Cerebral infarction of rats in the four groups圖1 4組大鼠腦梗死情況

2.3 各組大鼠大腦冠狀部形態變化 假手術組大腦冠狀部完整、清晰，皮層神經元細胞正常、排列整齊；模型組可見皮層神經元細胞排列紊亂，有明顯的炎癥細胞浸潤現象，纖維化嚴重；針刺組和陽性對照組皮層神經元細胞排列較紊亂，炎癥和纖維化現象減輕，見圖2。

Fig.2 Morphological comparison of the coronary region of rat brain in the four groups(HE staining,×200)圖2 4組大鼠大腦冠狀部形態學比較（HE染色，×200）

2.4 電針對大鼠大腦冠狀部miR-214相對表達水平的影響 假手術組、模型組、針刺組及陽性對照組的大腦冠狀部miR-214相對表達水平分別為（1.00±0.21）、（2.13±0.46）、（1.56±0.35）、（1.61±0.32），差異有統計學意義（n=8，F=14.207，P＜0.05），其中與假手術組比較，模型組、針刺組、陽性對照組大腦冠狀部中miR-214水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組、陽性對照組大腦冠狀部中miR-214水平降低（P＜0.05），而后2組間差異無統計學意義。

2.5 電針對大鼠大腦冠狀部PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6 的影響 與假手術組比較，模型組、針刺組、陽性對照組大腦冠狀部中PTEN，模型組細胞漿中NF-κB蛋白相對表達水平降低（P＜0.05），模型組大腦冠狀部中p-AKT/AKT、IL-6，陽性對照組細胞漿中NF-κB，模型組、陽性對照組細胞核中NFκB 蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，針刺組、陽性對照組大腦冠狀部中PTEN、p-AKT/AKT、細胞漿NF-κB 蛋白相對表達水平升高，細胞核NF-κB、IL-6 蛋白相對表達水平降低（P＜0.05），見圖3、表2。

3 討論

腦卒中屬傳統醫學“中風”范疇，為風痰瘀阻、痰熱腑實、氣虛血瘀、陰虛風動等證型［9］。傳統醫學根據其發病機制，通常采用活血化瘀、熄風化痰、通腑瀉火方案治療該病。針刺穴位有行氣活血、舒經活絡功效，可改善局部病灶處血液循環，抑制炎癥，緩解炎癥反應［10-11］。其中，陽陵泉歸于足少陽經合土穴，屬八會穴之一，有舒筋通絡、通經止痛功效；在治療膝關節骨性關節炎中可改善局部微循環，增加血液供應，從而達到清除致痛物質的目的［12］。曲池屬手陽明大腸經合穴，有激發經氣之功效；在治療過敏性鼻炎中可增加抗炎作用，減少巨噬細胞和T 淋巴細胞的分泌，促進局部致病因子分解，減少疼痛，亦可抑制毛細血管通透性增加［13］。本研究中，與假手術組比較，模型組、針刺組、陽性對照組Longa 評分升高，表明大鼠出現神經損傷情況，提示造模成功；模型組腦梗死體積增大，大鼠大腦冠狀部出現明顯的炎癥損傷和纖維化現象，提示腦卒中可致血液供應不足，促使冠狀部發生炎癥反應和纖維化，導致腦梗死發生。與模型組比較，針刺組Longa 評分降低，提示針刺可緩解大鼠神經損傷。針刺組腦梗死體積減小，大腦冠狀部炎癥減弱，提示針灸通過疏經通絡等作用可改善局部微循環及血液循環，從而促進部分梗死區域供血，恢復其功能，同時亦可改善炎癥現象，達到緩解疾病目的，但具體機制尚不明確。

miRNA 具有多重功能，高度保守且具有細胞特異性，可調控靶基因的轉錄、翻譯等過程，從而調控基因表達，影響其功能。其中，miR-214位于1 號染色體長臂（1q24.3）鈣離子重吸收相關基因Dnm3 基因內，影響皮層神經元、大腦皮層發育以及胚胎干細胞神經分化，從而影響神經發育和再生［14］。對小鼠骨關節炎模型的研究顯示，隨著病情加重，miR-214水平升高并加重了骨關節炎軟骨損傷［15］。而miR-214可抑制血管內皮細胞增殖，促進細胞凋亡和上調炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 表達水平［16］，但具體機制并不明確。有研究顯示，miR-214可通過靶向PTEN 來影響下游AKT/NF-κB/IL-6 信號通路的表達而發揮作用，進而影響細胞增殖、凋亡，及炎性因子表達水平［17-18］。另有研究顯示，潰瘍性結腸炎小鼠miR-214表達水平升高，PTEN表達水平降低，PTEN對AKT的抑制作用降低，導致AKT水平升高，進而促進轉錄因子NF-κB 分泌，上調IL-6、IL-1β、TNF-α等，發揮促炎作用［19］。本研究發現，與假手術組比較，模型組大腦冠狀部miR-214水平升高，p-AKT/AKT、細胞核NF-κB 和IL-6 蛋白水平升高，PTEN、細胞漿NF-κB 蛋白水平降低，表明腦卒中后miR-214水平升高可能導致炎癥反應加重以及相關蛋白表達水平的改變，提示腦卒中大鼠大腦冠狀部中miR-214水平異常升高后可能抑制PTEN表達，使PTEN 對AKT 的抑制作用減弱，AKT 活化水平升高，從而促進轉錄因子NF-κB由胞漿進入細胞核，促進促炎因子的分泌，加重炎癥反應及神經損傷。進一步研究發現，與模型組比較，針刺組miR-214水平降低，p-AKT/AKT、IL-6、細胞核NF-κB 蛋白水平亦降低，而PTEN、細胞漿NF-κB 蛋白水平升高，提示針刺可降低miR-214水平，而miR-214水平降低減弱對PTEN的抑制作用，促進PTEN水平升高，PTEN水平升高則加強對AKT 的抑制作用，AKT 受到抑制，從而降低轉錄因子NF-κB由胞漿進入細胞核過程，減少炎性因子分泌，減緩炎癥反應，實現對腦卒中大鼠腦組織的保護。

Fig.3 Protein levels of PTEN,AKT,p-AKT,NF-κB and IL-6 in the coronary region of rat brain in the four groups圖3 4組大鼠大腦冠狀部中PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6蛋白水平

Tab.2 Comparison of PTEN,AKT,p-AKT,NF-κB and IL-6 protein levels in coronary region of rat brain between the four groups表2 4組大鼠大腦冠狀部中PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6蛋白水平比較 （n=8，±s）

Tab.2 Comparison of PTEN,AKT,p-AKT,NF-κB and IL-6 protein levels in coronary region of rat brain between the four groups表2 4組大鼠大腦冠狀部中PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6蛋白水平比較 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與模型組比較，P＜0.05；針刺組與陽性對照組不做比較

組別假手術組模型組針刺組陽性對照組F PTEN 1.36±0.28 0.21±0.06a 0.89±0.14ab 0.95±0.21ab 49.876＊＊AKT 0.83±0.12 0.84±0.15 0.82±0.14 0.84±0.15 0.037 p-AKT/AKT 0.93±0.15 1.53±0.18a 0.96±0.17b 1.06±0.15b 23.421＊＊組別假手術組模型組針刺組陽性對照組F NF-κB細胞漿0.74±0.11 0.09±0.02a 0.78±0.05b 0.86±0.05ab 230.690＊＊細胞核0.26±0.04 0.90±0.12a 0.21±0.05b 0.41±0.05ab 151.213＊＊IL-6 0.15±0.01 0.86±0.12a 0.12±0.03b 0.21±0.05b 221.497＊＊

綜上所述，針刺腦卒中大鼠可減輕其腦組織炎癥損傷，可能是通過抑制miR-214水平及下游PTEN/AKT/NF-κB/IL-6 信號通路實現的；但miR-214影響的通路較多，亦可能影響別的通路，實現對炎癥的調節，需在進一步研究中發現其機制。