胰腺癌缺氧微環境的生物學作用

張 雨， 江建新

武漢大學人民醫院 肝膽外科， 武漢 430060

胰腺癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，號稱“癌中之王”，因早期診斷困難、手術切除率低以及放化療不敏感，預后極差，5年生存率僅為9%。據最新數據[1]，預估2019年美國胰腺癌男性與女性發病分別為29 940例和26 830例，發病率分別居腫瘤排行榜的第10位和第9位，而預計胰腺癌的死亡率居第4位。目前，中國胰腺癌總發病率和死亡率在所有惡性腫瘤中分別居第10位和第6位[2]。盡管近幾年胰腺癌的治療手段有所提高，但仍無里程碑性突破，其主要原因在于胰腺癌的發病機制尚未完全清楚。

1889年，Pagets[3]首次提出“種子與土壤”假說，認為腫瘤生長需要合適的環境，隨后腫瘤微環境的概念逐漸確立。腫瘤微環境是由腫瘤細胞、炎性細胞、內皮細胞、源于髓系的造血細胞、成纖維細胞、細胞外基質及各種生物活性分泌產物共同組成的內環境，參與腫瘤的發生、發展及轉移[4]。1955年以后，缺氧被認為是腫瘤微環境的特性之一。缺氧條件下，缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)會高表達，調節相關靶基因及各種細胞信號通路以耐受缺氧。癌細胞發生一系列代謝、生物學特性改變，包括糖脂代謝異常、異常血管新生、上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等，促進癌細胞不斷增殖，侵襲力加強，使其易于遠處轉移[5-6]。另外，缺氧使腫瘤相關巨噬細胞及嗜中性粒細胞向促瘤表型轉化，同時T淋巴細胞、自然殺傷細胞殺傷作用被抑制，有利于腫瘤的免疫逃避[7]。已有報道[8]，缺氧微環境還與放化療等治療抗性相關。在胰腺癌中，其微環境的顯著特性為極度缺氧，另一特性在于基質細胞分泌大量致密結締組織，這一過程由胰腺星形細胞(pancreatic stellate cell，PSC)介導[4,9]。缺氧的主要原因在于血管生成不足或形成異常滲漏血管導致低血流灌注；其次，胰腺癌不僅分泌促血管因子，也分泌內皮素等抗血管因子，且致密的基質壓迫血管導致缺氧進一步加劇[9]。總體而言，缺氧微環境在促進胰腺癌代謝重建、免疫逃避、增殖和轉移、耐藥等方面至關重要，多種生物學因子共同參與此過程，如血管內皮生長因子(vascular endorhelial growth factor，VEGF)、TGFβ、IL-10、趨化因子，而轉錄因子HIF作為核心調控因子，介導多種生物學作用發生。

HIF是一種異二聚體轉錄因子，存在3種功能形式(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)。常氧條件下，HIF-1α在脯氨酸羥化酶作用下羥化脯氨酸殘基，經希佩爾-林道蛋白介導的泛素-蛋白酶體途徑降解。缺氧時α亞基的降解活動顯著減弱，進入胞核與HIF-1β 結合形成具有活性的轉錄復合物，并與靶基因上游缺氧反應元件結合，參與缺氧引起的多種系統性反應[9-11]。HIF-1α已被證實在胰腺癌中過表達，其介導的生物學作用包括上調VEGF促進新生血管形成，上調基質金屬蛋白酶(MMP)和誘導EMT促進癌細胞侵襲和轉移，并通過改變巨噬細胞極化方向幫助腫瘤免疫逃避，還可上調糖酵解基因改變代謝途徑并與化療耐藥相關[7,9-11]。HIF-2α具有與HIF-1α相似的結構域，其作用相似但機制不同，甚至在特定的情況下二者的功能截然相反[10]。Wang等[12]通過檢測HIF-1α和HIF-2α mRNA及蛋白質水平，發現高表達的HIF-2α可能與胰腺癌的良好預后相關。關于HIF-3α，以往認為其抑制HIF-1α和HIF-2α的功能，而近年來提出HIF-3α可能作為HIF-1α的靶基因在缺氧時起作用并促進胰腺癌轉移[13]。

1 缺氧微環境對胰腺癌的作用及機制

1.1 缺氧參與胰腺癌代謝重建

缺氧時，細胞中葡萄糖正常代謝途徑氧化磷酸化受阻，線粒體內膜電子呼吸鏈傳遞異常，導致ATP生成減少及活性氧(ROS)增多。ROS進一步導致線粒體損傷，并依賴溶酶體途徑誘導自噬[14]。為適應缺氧環境，滿足癌細胞生長發育的能量需求，細胞的代謝過程會重新建立，主要通過HIF-1激活，關閉氧化磷酸化促進糖酵解，并調節谷氨酰胺代謝及推動三羧酸循環向脂肪酸合成代謝轉變[15-17]。缺氧可上調脂肪酸合酶基因的表達，也通過HIF-1誘導VEGF激活多種信號通路，如RAS/RAF/ERK和PI3K/Akt通路，進一步促進脂質合成[15-16]。在胰腺癌的代謝重建中，異常糖代謝途徑和改變來源的乙酰輔酶A(acetyl coenzyme A，乙酰CoA)的脂質合成途徑至關重要。

1.1.1 有氧糖酵解 正常細胞有氧時通過氧化磷酸化供能，缺氧時進行糖酵解，但在腫瘤細胞中，即使是在有氧條件下糖酵解途徑也異常增強，該過程為有氧糖酵解，又名“Warburg效應”。缺氧時，HIF-1α活化，靶向上調糖酵解及葡萄糖轉運載體基因，加強葡萄糖攝取，導致丙酮酸無法氧化脫羧而生成乳酸，從而迅速產生大量ATP，比正常氧化磷酸化快100倍，并參與核酸、脂肪等大分子合成以滿足癌細胞快速增殖需要。同時，有氧糖酵解使線粒體內ROS、CO2、ATP及檸檬酸鹽產生減少，有利于基因穩定，降低ATP和檸檬酸鹽對糖酵解關鍵酶磷酸果糖激酶1(phosphofructokinase 1，PFK1)的抑制作用，CO2生成減少亦有利于維持胞內堿性環境，提高PFK1活性，并抑制氧化磷酸化[15,17]。

1.1.2 谷氨酰胺代謝途徑 谷氨酰胺再攝取增強是肝癌、肺腺癌等的一個顯著特征，胰腺癌中谷氨酰胺代謝紊亂是腫瘤發生所必需，其在三羧酸循環中間產物的再生、脂質合成以及還原型輔酶Ⅱ(NADPH)產生中尤為重要。谷氨酰胺進入線粒體，在谷氨酰胺酶的作用下分解為氨和谷氨酸，后者進入兩條代謝通路。(1)非經典谷氨酰胺代謝途徑：谷氨酸經谷草轉氨酶1生成天冬氨酸，天冬氨酸出線粒體后，在致癌基因KRAS介導的天冬氨酸轉氨酶/谷草轉氨酶1作用下生成草酰乙酸，草酰乙酸經蘋果酸脫氫酶1變為蘋果酸，蘋果酸再經蘋果酸酶1脫氫生成丙酮酸，同時生成NADPH還原當量，參與氧化還原反應，減少ROS生成，促進癌細胞生長。(2)經典谷氨酰胺代謝途徑：谷氨酸經谷氨酸脫氫酶1生成α-酮戊二酸，可直接參與三羧酸循環并在胞漿內通過mTOR信號抑制自噬過程。研究[15]發現，與其他腫瘤依賴谷氨酰胺攝取增強生存力不同，胰腺癌中，谷氨酰胺再攝取最終會抑制癌細胞生存。探討其原因，在腫瘤代謝中，自噬具有雙重調控作用，一方面激活自噬性死亡途徑殺滅瘤細胞；另一方面，癌細胞可通過自噬獲取能量逃避凋亡。在胰腺癌的缺氧微環境下，發現其自噬水平升高，可能的原因是部分腫瘤細胞通過自噬作用代謝自身相關物質為周圍的腫瘤細胞提供營養。另有研究[18]發現，自噬可能與ROS減少和維持基因穩定相關。

1.1.3 改變來源的乙酰CoA的脂質合成途徑 脂肪酸合成對于癌細胞的生長必不可少，參與細胞分裂等重要過程。乙酰CoA是合成脂肪酸的主要原料，正常情況下主要通過丙酮酸在線粒體氧化脫羧生成，而胰腺癌細胞由于缺氧阻斷了葡萄糖的有氧氧化，為適應生存，乙酰CoA來源通過其他途徑替代。(1)非經典谷氨酰胺代謝途徑中，谷氨酸經谷氨酸脫氫酶1生成α-酮戊二酸，經異檸檬酸脫氫酶1生成異檸檬酸，后者在胞漿中生成檸檬酸。(2)原癌基因c-Myc介導的谷氨酰胺代謝經三羧酸循環直接生成檸檬酸，檸檬酸在胞漿經ATP檸檬酸裂解酶進一步裂解生成乙酰CoA。(3)胞漿中，乙醛經乙醛脫氫酶變為乙酸，在酰基輔酶A合成酶短鏈家族成員2作用下生成乙酰CoA。最后共同通路為乙酰CoA合成脂肪酸[16]。

1.2 缺氧與胰腺癌細胞免疫逃避 間質細胞是胰腺癌微環境的重要組成成分，包括PSC、調節性T淋巴細胞(Treg)、髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)以及腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)。免疫抑制是腫瘤微環境特性之一，其機制復雜多變并與缺氧密切相關[6]。缺氧時，上調的HIF-1α激活PSC變為肌成纖維細胞樣表型，活化的PSC可以增加Ⅰ型膠原密度并干擾趨化因子受體引導T淋巴細胞歸巢[19]，還可分泌TGFβ、IL-6、galectin-1等多種因子，其中CXC趨化因子配體(CXC chemokine ligand，CXCL)12表達能阻止CD8+T淋巴細胞遷移至腫瘤基質，而galectin-1可促進T淋巴細胞凋亡和Th2細胞因子分泌實現免疫抑制[6]。

PSC還通過IP-10/CXCL10途徑招募Treg幫助癌細胞免疫抑制。Treg是一種抑制性T淋巴細胞，可分泌免疫抑制因子IL-10、TGFβ抑制效應性T淋巴細胞或分泌galectin-1促進T淋巴細胞凋亡，并且通過高表達細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4使樹突狀細胞和效應性T淋巴細胞上調吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)，而IDO及其代謝產物犬尿氨酸與免疫抑制相關。PSC亦通過IL-6/STAT3信號促進MDSC形成，后者可由IL-10、TGFβ誘導釋放ROS，激活caspase級聯反應并引起T淋巴細胞凋亡。同時，MDSC可以通過改變抗原來誘導CD8+T淋巴細胞免疫耐受，并通過精氨酸酶1和誘生型一氧化氮合酶消耗L-精氨酸使T淋巴細胞無法增殖；STAT3磷酸化后還可上調表面的程序性死亡配體-1抑制T淋巴細胞激活[6]。

缺氧時，HIF-2α及IL-4、IL-10、IL-13和巨噬細胞集落刺激因子等，可促進巨噬細胞向免疫抑制表型M2型分化，促進胰腺癌增殖[5,16]。微環境還可分泌VEGF、IL-10、IL-6和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等防止樹突狀細胞成熟，未成熟樹突狀細胞可以減少共刺激分子CD40和CD80的表達來防止T淋巴細胞激活，同時產生趨化因子22招募Treg促進腫瘤存活，但缺氧對于樹突狀細胞的作用仍有爭議[19-20]。

1.3 缺氧與胰腺癌的增殖和凋亡 缺氧條件下，HIF-1α可以加強糖酵解等能量物質轉換，上調紅細胞生成素及VEGF，這些變化均推動了腫瘤的惡性增殖。不受調控的生長是惡性腫瘤的特性之一，許多研究表明缺氧在其中起著不可替代的作用。Jein等[21]發現，缺氧通過HIF-1α與近端缺氧元件B7-H4啟動子結合，誘導胞漿中B7-H4高表達，后者可影響細胞周期進展，增加S期細胞群促進增殖，而沉默B7-H4后，細胞凋亡數增加且增殖活性下降。另外，Barbu等[22]研究表明，在胰腺內分泌瘤的轉基因小鼠中，由缺氧介導的脯氨酸表達增加，可推動細胞周期進展和細胞生長并推測其依賴于激活ERK通路。

Bcl-2相互作用蛋白3(Bcl-2 interacting protein 3，BNIP3)是缺氧誘導細胞凋亡的關鍵信號，可抑制細胞增殖。Li等[23]報道，BNIP3因為啟動子甲基化不能與HIF-1α結合，在胰腺癌中表達沉默，與正常表達BNIP3細胞相比，其促凋亡蛋白Bax表達和細胞凋亡數減少，抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，提示BNIP3是細胞抗凋亡及耐藥靶點之一。Harashima等[24]發現，在沉默HIF-2α的胰腺癌細胞系中，檢測到TNF相關的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的敏感性增高，生存素(survivin)表達減少；而在高表達HIF-2α細胞中發現凋亡相關分子減少，survivin高表達。該研究還檢測到HIF缺氧應答元件中存在與survivin啟動子一致的序列，暗示了HIF-2α可以上調survivin表達，降低TRAIL敏感性，促進凋亡抵抗過程。以膠質瘤、肝癌和肺癌患者為研究對象[25]，結果發現缺氧可以激活SOX-2、CT-4、KLF-4、Nanog和Lin-28A等轉錄因子，這些基因在控制細胞去分化及形態重塑中起著重要作用，并增加干細胞標志物的表達，誘導腫瘤球的形成及不對稱的細胞分裂，使細胞周期停滯在G0/G1期，這些都是腫瘤干細胞的特性。已經證實，在胰腺癌中也存在SOX-2推動去分化過程，因此推測缺氧可能通過去分化誘導腫瘤干細胞形態形成，增加惡性程度。

1.4 缺氧與胰腺癌侵襲和轉移 作為乏氧性實體瘤，胰腺癌通過各種途徑促進血管和淋巴管生成以滿足營養需求，這也有利于癌細胞的進一步擴散轉移。鄭剛等[26]研究發現胰腺癌中HIF-1α mRNA表達上調，且與VEGF mRNA表達呈正相關，說明HIF-1α可通過上調VEGF 表達促進血管生成。缺氧時，基質細胞會分泌大量促血管生成因子，其中VEGF至關重要，并由STAT3信號、黏蛋白1、核因子-κB(NF-κB)、TAM等調節。此外，M2型巨噬細胞和CD10+PSC還可促進淋巴管再生并驅動淋巴結轉移，且VEGF-C/D可能也與之相關[6]。Yang等[27]發現，HIF-2α高表達可以通過調節Twist1與血管內皮鈣黏蛋白的結合致胰腺癌血管擬態形成。血管生成擬態是一種獨立于內皮細胞血管生成的血液供應方式，與胰腺癌轉移密切相關。

許多報道中，EMT在胰腺癌侵襲轉移中發揮著獨特作用[6,9-10]。王時光等[28]通過檢測HIF-1α、轉錄因子Snail、N-鈣黏附素、E-鈣黏附素的表達，證實了在缺氧時HIF-1α介導EMT 促進胰腺癌細胞侵襲遷移。吳飏等[29]也發現缺氧微環境中PSC可通過CCL7/CCR5軸誘導EMT促進胰腺癌侵襲。EMT可使細胞黏附能力及極性丟失，突破基底膜入侵局部靜脈，抑制細胞凋亡并賦予其干細胞特性增加侵襲力[6,9-10]。除HIF-1α作用外，Zhang等[30]研究了HIF-2α和β-連環素(β-catenin)在胰腺癌中的相互作用，發現HIF-2α可上調β-catenin活性進而調節EMT過程，并促進癌細胞增殖、轉移。

Zhou等[13]研究證明，缺氧時HIF-3α表達上調，增加磷酸化肌球蛋白輕鏈2水平，暗示RhoC-ROCK1通路激活，并減少了胰腺癌患者生存時間，促進轉移。RhoC屬于小分子G蛋白超家族中的Rho亞家族，與細胞骨架運動調控、細胞形態建成相關，且涉及細胞黏附、細胞基質相互作用。因此，HIF-3α表達上調可以促進胰腺癌局部浸潤和遠處轉移。HIF-1α還通過MMP，如MMP-2和MMP-9表達增加，降解細胞外基質促進癌細胞轉移[6,11]。PSC在促進腫瘤轉移和侵襲中發揮了重要作用，PSC可以通過Galectin-1分子激活NF-κB途徑來分泌基質細胞衍生因子-1促進轉移，也分泌肝細胞生長因子(HGF)與癌細胞表面c-Met結合通過HGF/c-Met/survivin信號發生轉移[6]。此外，腫瘤免疫逃避也參與了其侵襲和轉移。

1.5 缺氧與胰腺癌治療耐藥相關性 胰腺癌缺氧微環境激活PSC，促纖維化及致密結締組織形成并與缺氧形成惡性循環。致密結締組織導致的血管塌陷以及腫瘤中心的低血流灌注，共同阻止了藥物滲透，是導致胰腺癌耐藥的機制之一[31]。Grasso等[32]討論了胰腺癌異常糖代謝與耐藥相關性，認為可能與某些糖代謝調節酶相關，如己糖激酶(HK)、果糖-二磷酸醛縮酶(FBA)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)在缺氧時過表達。HK2可以直接插入線粒體外膜對抗凋亡，由PI3K/Akt/mTOR通路啟動，從而促進耐藥。FBA通過抑制caspase3的活性延緩凋亡，而GAPDH可以通過促進糖酵解、自噬，阻止caspase非依賴性死亡途徑，上述改變均提高了耐藥性。此外，代謝產物乳酸的積累，通過NDRG3蛋白與C-Raf結合開啟生存信號，同時促進藥物治療抵抗。

胰腺癌EMT也被證實與治療耐藥密切相關，多項研究提示EMT細胞對胰腺癌治療藥物包括表皮生長因子受體抑制劑、吉西他濱、VEGF抑制劑有抗性，如表達EMT標記的胰腺細胞對表皮生長因子受體抑制劑的抵抗力增強，在抗吉西他濱的胰腺癌細胞中間質波形蛋白、ZEB1、Notch通路產物及其下游信號NF-κB表達均上調，推測胰腺癌可能依賴Notch信號通路誘導EMT。在某些抗VEGF的細胞中，其促炎因子水平升高，可招募CD11b+血管生成性髓樣細胞誘導EMT[33]。He等[34]發現缺氧還可通過激活ERK1/2/HIF-1α調節ATP結合盒G亞家族成員2(ATP-binding cassette subfamily G member 2，ABCG2)活性，而ABCG2與多藥耐藥相關，作為一個可能的耐藥靶點促進胰腺癌耐藥。Luo等[35]研究顯示，miR-301a在低氧誘導的胰腺癌吉西他濱耐藥中起重要作用。TAp63為p63家族成員之一，能促進HIF-1α降解對抗耐藥。缺氧時miR-301a依賴于NF-κB途徑上調，可以使TAp63表達降低，促進吉西他濱耐藥。

2 總結

胰腺癌發生的微環境復雜多變，缺氧作為其重要特性之一，與腫瘤的發生、發展及轉移密切相關。腫瘤快速生長導致血流供應不足是缺氧發生的早期條件，而結締組織增生及大量纖維化使缺氧進一步加劇。為適應缺氧，避免凋亡并獲得持續增殖，一系列信號通路及調節因子分泌，重建癌細胞的能量代謝，促進微環境血管再生并誘導EMT過程增強侵襲力，同時調節免疫系統達到免疫抑制并對抗凋亡途徑。總之，胰腺癌缺氧微環境與患者的不良預后、早期轉移、治療效果不佳有關，根據其生物學作用，一系列新的治療策略如抗VEGF、免疫靶向治療成為當下研究熱點。因此，進一步探究缺氧微環境在胰腺癌中的具體作用以及分子機制，對提高胰腺癌療效至關重要。