腸道菌群與原發性肝癌

王飛雪，于 君

原發性肝癌(PLC)是我國乃至全球惡性程度較高的消化道腫瘤。2018年全球腫瘤流行病學調查結果顯示，肝癌在腫瘤發病率和相關死亡率方面分別位列第六位和第四位[1]。晚期診斷、術后易復發和治療選擇局限是造成肝癌患者預后差的主要原因。提高疾病的早期診斷和改善臨床治療效果對于解決目前原發性肝癌高死亡率具有重要的意義。近年來，大量關于腸道菌群的研究揭示了這個既往“被忽視的器官”在人類健康和疾病中扮演的重要角色。從早期的借助測序技術進行的菌群分析的描述性研究到現階段關于腸道菌群在健康狀態和疾病發生發展過程中的作用機制探索，越來越多的證據表明腸道菌群在包括炎癥性疾病、代謝性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤在內的多種疾病的發生發展過程中發揮重要的作用，將菌群相關的研究成果轉為為臨床應用，包括疾病的診斷和治療，是目前研究的方向。在這里，我們對腸道菌群與原發性肝癌的相關研究進行了闡述。

1 腸肝軸和腸粘膜屏障：腸道菌群和肝癌之間的解剖學基礎

腸肝軸的概念最早是由病理生理學家提出，用來描述腸道和肝臟之間的雙向聯系。一方面，門脈系統收集來自腸道的血液為肝臟提供了將近75%血供，包括營養物質和腸道菌群的代謝產物都可以經門靜脈系統進入肝臟；另一方面，肝臟生成的各種物質可以經過膽道系統進入腸道，進而影響腸道的微環境。由門脈系統和膽管系統組成這種雙向的肝腸軸聯系是腸道菌群和肝臟疾病相互作用的解剖學基礎。與腸肝軸相對應的功能學結構是腸黏膜屏障，它是維持機體穩態的重要結構。現有的觀點認為腸黏膜屏障可以分為三部分，首先是位于黏膜上皮細胞表面的粘液層，包括杯狀細胞分泌的抗菌肽和各種免疫球蛋白，是分隔機體與外界環境的第一道生理屏障；其次，由緊密連接的腸道黏膜上皮細胞構成腸黏膜的物理屏障，保證了腸黏膜的選擇性透過性；最后，位于上皮黏膜細胞間的各種免疫細胞構成腸道黏膜的免疫屏障[2]。多重屏障使腸肝軸不僅僅是簡單的解剖學通路，更是維持機體穩態的功能性結構，它保證了即使大量的外界微生物和刺激因子通過腸道，只有有限的物質可以通過腸粘膜屏障參與到腸肝循環中。

2 菌群失衡和腸泄漏：腸道菌群作用于肝癌的表現

肝腸循環及正常的腸道黏膜屏障是維持機體穩態的必要條件。在肝癌患者中，腸道菌群失衡和腸泄漏(leaky gut)則是兩個重要表現，這也從側面反映了腸道菌群在疾病發生發展中的可能作用。Qin et al在對肝硬化患者和健康人群的糞便進行菌群分析和宏基因組關聯分析，得到肝硬化患者特征性腸道菌群和相關基因譜，認為在肝硬化患者中明顯改變的腸道菌群組成有一定的臨床診斷價值[3]。通過對來自中國不同區域的419例糞便樣本進行16sRNA測序分析，結果顯示從健康狀態到肝硬化階段，腸道菌群豐度逐漸降低。但是，與肝硬化患者比，早期肝癌伴肝硬化患者菌群豐度有所升高[4]。同樣，在基于西方人群的研究中，在比較分析非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver diseases, NAFLD)、NAFLD相關性肝硬化、肝癌患者和健康對照腸道菌群譜發現，不同疾病階段腸道菌群譜與系統性炎癥密切相關[5]。不同疾病階段菌群組成的動態變化反映了腸道菌群和肝癌發生發展的密切關系。

腸泄漏是針對正常的腸黏膜屏障受損提出的一個通俗的概念。大量的研究證據表明腸黏膜通透性改變是一種普遍的病理學信號，在包括炎癥性疾病、代謝性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病等多種疾病中均有所表現[6-7]。根據腸黏膜屏障的主要構成，多種檢測腸道通透性的方法在臨床和基礎研究中得到應用。人口服攝取探針后，通過檢測尿液中分泌比例可以間接地反映腸道通透性。在活檢組織，通過電子顯微鏡和蛋白質電泳方法檢測緊密連接蛋白，如ZO-1[8]和 Claudin-1[9]表達可以直接提示腸道黏膜屏障的完整性[10]。除此之外，檢測血清革蘭氏陰性菌的細胞壁主要成分脂多糖(LPS)等內毒素的方法是反映腸黏膜屏障功能的間接方法。Higashi Y比較分析了肝癌患者腸道Claudin-1表達情況，發現其表達水平與肝癌細胞低分化和門脈浸潤密切相關[11]。在一項前瞻性隊列研究中，Fedirko V分析了肝癌患者血清抗脂多糖水平，結果證實抗體響應率與肝癌發生風險呈正相關，由此認為腸泄漏導致的菌群產物異位分布在肝癌的發生發展過程中扮演重要的角色[12]。基于人群的菌群分析和腸黏膜屏障破壞的描述性分析可以反映腸道菌群和肝癌發生發展的相關性，但并不足以作為說明腸道微生物參與肝癌的發生發展。無菌小鼠模型和抗生素介導的菌群清除的動物實驗為進一步驗證腸道微生物在肝癌發生過程中發揮的作用提供了直接的有力證據，多個研究表明清除腸道微生物可以抑制肝癌的進展[13,14]。

3 免疫和代謝：腸道菌群作用于肝癌的主要機制

病毒感染、酒精和代謝異常等多種慢性致病因素導致的菌群失衡和腸泄漏使肝臟和腸道菌群及其代謝產物直接接觸，進而引起菌群和肝臟的直接作用。現有的觀點認為，免疫和代謝是菌群和肝臟相互作用的主要機制。病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)是腸道菌群通過介導免疫通路影響肝癌發生發展的理論基礎。腸道菌群及其相關產物作為外界刺激因子可以被機體的免疫系統識別，引起一系列的免疫反應。目前，研究比較充分的是脂多糖-Toll樣受體4(TLR4)通路。脂多糖是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，可以激活TLR4，引起相關促炎反應，并能夠促進肝細胞的分化，抑制細胞凋亡，促進肝癌的進展[13-15]。另一方面，相關研究證實腸道菌群也參與了肝臟腫瘤免疫微環境的調控。在肥胖相關性肝癌的動物模型中，腸道革蘭氏陽性菌細胞壁的主要成分脂壁酸(lipoteichoic acid，LTA)向肝臟移位可以調節肝星狀細胞的表型變化和上調環氧合酶2(COX2)，后者可以抑制抗腫瘤免疫，促進肝癌的發展[16]。

代謝是腸道菌群參與肝癌進展的另一重要機制。目前，大量研究證實膽汁酸代謝在腸道菌群和肝癌的聯系中發揮重要作用[17,18]。在肥胖相關性肝癌的研究中，Yoshimoto S et al證實肥胖引起菌群代謝產物次級膽汁酸脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)水平上升，通過門脈系統進入肝臟的DCA可以引起肝臟星狀細胞向衰老相關的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)轉化，從而分泌各種促炎因子和促癌分子，促進肝癌進展[19]。Greten TF團隊在2018年發表于Science上的研究，借助于抗生素介導的菌群清除模型和相關免疫缺陷小鼠模型，證實腸道菌群通過調節膽汁酸代謝影響肝竇內皮細胞表面趨化因子CXCL16表達，進而調節NKT細胞在肝臟中的募集，控制抗腫瘤免疫，參與肝癌的發生發展[14]。短鏈脂肪酸(SCFA)是另一類主要的菌群代謝產物。Singh et al研究發現可溶性纖維素飲食在改善代謝綜合征的同時引起膽汁淤積并促進肝癌的發生，這一促進作用依賴于腸道菌群分解纖維素產生的SCFA而實現[20]，這一研究結果對高纖維素飲食有利于健康的傳統觀念產生了極大的沖擊。通過建立高脂高膽固醇飲食誘導的小鼠NAFLD相關性HCC模型，我們團隊的最新研究證實高膽固醇可以通過引起腸道菌群和菌群代謝產物的改變，包括牛磺膽酸(taurocholic acid，TCA)的增加和3-吲哚丙酸(3-indolepropionic acid，IPA)的減少，促進肝癌的發生，給予模型小鼠降脂藥物處理和腸道菌群調控可以有效緩解腫瘤進展[21]。現階段，對于腸道菌群、代謝、免疫和肝癌之間的復雜聯系尚需更加全面系統和深入的研究。

4 早期診斷、干預和治療：腸道菌群在肝癌患者中的臨床應用

從臨床發現問題，最終服務于臨床是醫學科學研究的終極目標。如何將腸道菌群應用于肝癌的早期防治和治療是我們進行大量基礎研究的主要目的。將腸道菌群應用到肝癌的早期診斷和臨床治療是目前的主要方向。在肝癌的早期診斷方面，通過分析和比較不同階段慢性肝臟疾病和肝癌患者腸道菌群組成，鑒定出肝癌患者的特征性菌群譜，作為臨床診斷標記物是一個方向。通過分析中國人群早期肝癌患者和健康對照在慢性肝臟疾病不同階段的菌群組成，研究者確定了最佳的30種微生物標記物，并在中國西北部和中部地區的隊列研究中得到了跨區域交叉驗證，證實了特征性腸道菌群標記物在肝癌診斷中的巨大的應用潛力[4]。也有研究者從血清循環菌群及微生物DNA入手，通過對肝癌、肝硬化和健康人群血清進行宏基因組學分析，結合針對血清微生物DNA的高通量焦磷酸測序，定義了一組肝癌患者特異性的血清微生物宏基因組學特征譜，并構建了基于5個微生物基因的肝癌診斷模型，其受試者工作特征曲線下面積(AUC)可以達到0.879，準確度也達到了0.816[22]。與傳統的診斷手段相比，通過分析比較單純肝硬化患者和肝硬化伴早期肝癌患者腸道菌群組成，基于腸道菌群和相關代謝產物尋找特異性標記物可以實現對肝硬化患者的定期無創檢測，從而提高肝癌的早期診斷。

將腸道菌群應用于高危人群的早期預防和輔助臨床治療是其臨床應用的另一主要方向。一方面，從腸道菌群參與肝癌發生的分子機制出發，開發相關靶點藥物，包括TLR拮抗劑、FXR激動劑和相關細菌代謝產物抑制劑，應用于高危人群早期預防是腸道菌群臨床轉化的主要思路，臨床已經開展相關靶點藥物的研究。另一方面，益生菌和菌群移植是調控腸道菌群的直接方法。在基于動物模型的研究中，肝癌小鼠模型在接受混合益生菌處理后，腫瘤大小和個數顯著下降，伴隨腸道菌群失衡的改善和免疫微環境的變化，具體表現為可以有益菌增加、抑制炎癥性代謝產物增加[23]。但是，通過直接調節腸道菌群對肝癌高危患者進行干預和治療在臨床上應用的可行性并不大，目前還沒有相關的臨床研究。此外，將腸道菌群應用到肝癌患者的臨床治療也是一個潛在的方向。鑒于腸道菌群在調節腫瘤免疫的重要作用，是否能夠將菌群調節運用到肝癌患者的臨床聯合治療是一個很好的方向。腸道菌群和腫瘤免疫治療的臨床應答已在黑色素瘤和肺癌中得到了初步驗證。那么，能否通過菌群調節提高肝癌患者的免疫治療效果？一項在肝癌患者中聯合應用PD-1受體抑制劑(Nivolumab)、萬古霉素和他達拉非的臨床研究(NCT03785210)目前正在招募患者階段。毫無疑問，該研究結果將對肝癌患者的免疫治療產生重大的影響。

我們系統總結了腸道菌群參與肝癌發生發展過程的理論依據和現階段的研究進展，腸道菌群在調節機體免疫和代謝方面的巨大潛力及其與肝臟之間密切的解剖學和功能聯系為它在肝癌發生發展中發揮作用研究提供了理論依據。將基于菌群在肝癌發生中相關基礎研究成果轉化為臨床應用是目前肝癌診斷和治療領域的一個熱點，能否將腸道菌群應用于肝癌患者的早期診斷并聯合應用于免疫治療，將有待進一步研究和闡明。