腸道微生態與自身免疫性肝病*

王 睿，王綺夏，馬 雄

自身免疫性肝病(autoimmune liver disease, AILD)是一類病因尚不明、具有自身免疫基礎的慢性肝病。AILD的特點為機體對自身肝臟組織失去耐受，肝臟出現病理性炎癥損傷，血清可發現與疾病相關的自身抗體。根據肝臟內受累細胞的不同，可將AILD分為：累及肝細胞為主的自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)、累及膽管細胞為主的原發性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)、原發性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)和IgG4相關硬化性膽管炎(IgG4 related cholangitis, IgG4-SC)等。AILD的發病機制尚未闡明，目前認為遺傳易感性、環境促發因素、免疫功能異常等多因素參與其中。腸道與肝臟通過門靜脈、膽道和全身血液循環，在解剖和功能上緊密聯系、相互影響，稱為“腸肝軸”(gut-liver axis)。目前，腸道微生態(intestinal microbiota)參與肝臟發病機制的研究多聚焦于非酒精性肝臟疾病和酒精性肝臟疾病。近期，馬雄團隊首次揭示了我國AIH和PBC患者腸道菌群的組成、功能變化及其相關代謝物的改變，提示應用腸道微生態作為非侵入性生物標志物，具有用于疾病分層的轉化醫學潛力。

1 自身免疫性肝病患者腸道微生態特征

AIH的特點為血清出現自身抗體、血清轉氨酶和免疫球蛋白G升高、肝組織檢查顯示中度至重度界面性肝炎，治療上對糖皮質激素和免疫抑制劑有應答[1]。近期，美國肝病學會(AASLD)發布了2019年成人和兒童AIH診斷和治療的臨床實踐指引[2]，總結了腸屏障破壞、循環中出現腸道細菌來源的脂多糖等腸道微生態因素可參與AIH的發生發展，有望成為治療新靶點。本課題組通過比較未經糖皮質激素治療的AIH患者與健康人，揭示了AIH患者腸道菌群失調的特征[3]。該研究應用16S rRNA基因測序對91例AIH患者和98例健康人進行橫斷面研究，另外設置了98例AIH患者和34例健康人作為獨立隊列進行驗證。與健康人比，AIH患者腸道菌群多樣性下降、整體菌群組成發生改變，其特征為專性厭氧菌減少、潛在致病菌，如韋永氏球菌(Veillonella)富集。其中，殊異韋永氏球菌(Veillonelladispar)與AIH疾病嚴重程度的相關性最強，與血清AST水平、肝臟炎癥程度呈正相關。應用AIH相關的四個菌屬，包括韋榮氏球菌、乳酸桿菌(Lactobacillus)、顫螺旋菌(Oscillospira)、梭菌目(Clostridiales)構建多變量邏輯回歸模型，其AUROC可達0.8，可較準確地區分AIH患者和健康人。隨后，Liwinski et al[4]對AIH患者進行糞菌測序，證實了殊異韋榮氏球菌與疾病嚴重程度的相關性，同時發現雙歧桿菌(Bifidobacterium)含量下降與AIH患者預后不良呈正相關。

PBC的特點為肝內進行性非化膿性小膽管破壞，可伴門靜脈炎癥、肝臟纖維化，絕大多數PBC患者血清抗線粒體抗體(antimitochondrial antibody, AMA)陽性，特別是AMA-M2亞型陽性對本病診斷的敏感性和特異性高，部分PBC患者可出現抗核抗體(antinuclear antibody, ANA)陽性，如抗核孔膜蛋白(gp210)、抗核小體蛋白(sp100)陽性，臨床主要給予熊去氧膽酸(ursodexoycholic acid, UDCA)治療。本課題組[5]對PBC患者腸道菌群進行了橫縱向研究。橫斷面研究納入了60例未經UDCA治療的PBC患者和80例健康人，縱向研究則納入了37例UDCA治療6個月前后的PBC患者。與健康人比，PBC患者糞菌群結構發生了改變(8個菌屬上調、4個菌屬下調)。其中，克雷伯菌(Klebsiella)在PBC患者中上調，與血清總膽紅素水平呈正相關。通路分析顯示，PBC患者細菌入侵上皮通路上調，與腸桿菌科細菌豐度增加有相關性。值得注意的是，經UDCA治療后，有變化的菌屬中有6個菌屬趨于正常化，提示UDCA作為促內源性膽汁酸(bile acid, BA)分泌藥物，可調節PBC患者腸道微生態，進而緩解病情。循此思路，本課題組[6]進一步分析了PBC患者血清和糞便BA譜以及BA與腸道菌群的關聯，結果顯示PBC患者BA代謝異常，表現為結合型轉化為未結合型BA、初級轉化為次級BA的過程受阻。UDCA治療可降低牛磺酸結合BA水平，從而改善結合型/未結合型比例。此外，結合型BA和次級BA水平與PBC患者上調的菌屬(如韋永氏球菌、克雷伯菌)呈正相關，與健康人上調的菌屬(如糞桿菌(Faecalibacterium)、顫螺旋菌)呈負相關。

PSC的特點為炎癥累及肝內、外膽管，引起膽管硬化、阻塞和結構破壞，導致慢性膽汁淤積、膽管纖維化，最終可進展為肝硬化和肝功能衰竭。部分PSC患者合并炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)，其比例因地區、人種不同呈現較大的差異。有研究指出，大多數PSC-IBD患者存在結腸炎癥，其腸道微生態特征類似于典型的PSC和IBD患者[7,8]，提示腸道微生態失衡可能參與了PSC的發生發展。目前，國外已開展了多項關于PSC患者糞便和腸道黏膜菌群的研究，與健康人比，PSC患者菌群多樣性較低，腸球菌(Enterococcus)、梭菌屬(Fusobacterium)和乳酸桿菌水平上調[9-11]。

IgG4-SC的特點是血清IgG4水平升高、膽管內和肝組織IgG4陽性漿細胞浸潤，常伴發自身免疫性胰腺炎及纖維化性疾病。該類患者的腸道微生態特征有待進一步闡明。

2 腸道微生態在自身免疫性肝病發病過程中的作用

2.1 腸道細菌異位激活肝臟免疫可加重肝病進程 在生理狀態下，腸道上皮細胞及相關成分(黏液層、抗菌肽、免疫球蛋白、共生菌等)共同構成屏障，同時腸系膜淋巴結、肝臟依次作為免疫“防火墻”，限制腸道菌群異位至其他器官。在病理狀態下，發生“腸漏”(leaky gut)，細菌及其代謝物可通過門脈進入肝臟，造成肝臟的炎癥及損傷。研究表明[8]，SC患者腸道肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)可破壞腸上皮，促使其他細菌，如奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)、鶉雞腸球菌(Enterococcusgallinarum)一同穿過腸屏障，進而引起Th17細胞介導的肝臟炎癥反應。另有一項研究[12]指出，鶉雞腸球菌可穿過腸上皮，到達腸系膜、腸系膜淋巴結、肝臟和脾臟等多個器官，從而引發自身免疫性疾病，如AIH、系統性紅斑狼瘡。應用鶉雞腸球菌特異的FISH探針，在肝臟中可檢測出鶉雞腸球菌。在動物實驗應用抗生素或特定疫苗能抑制鶉雞腸球菌生長，進而緩解疾病。

在腸道微生態失衡的背景下，機體發起針對細菌抗原的免疫反應，同時可攻擊結構相似的機體自身抗原，從而誘發自身免疫反應[13]。研究表明，從AILD患者分離出的自身抗體可與特定的微生物蛋白發生反應。例如，自PBC患者來源的抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody, AMA)可與大腸埃希菌(Escherichiacoli)蛋白結合[14]，自PBC患者來源的IgG3自身抗體可與德氏乳酸桿菌β半乳糖苷酶(Lactobacillusdelbrueckiiβ-galactosidase, BGAL)結合，同時BGAL與PBC自身抗原PDC-E2亞單位的相似性可達67%[15]；自PSC患者來源的核周型抗中性粒細胞抗體(peripheral antineutrophil cytoplasmic antibody, p-ANCA)則可與細菌細胞分裂蛋白FtsZ結合[16]。

具有遺傳易感性的個體可能存在限制腸菌異位的免疫系統功能受損。多項關于全基因組關聯分析的研究指出[17,18]，PSC-IBD患者存在CARD-9、FUT-2和MST-1等遺傳易感位點，而這些位點編碼的蛋白參與腸道固有免疫及適應性免疫。FUT-2突變基因攜帶者發生膽道感染及梗阻的風險增高[19,20]。CARD-9則作為NOD2和TLR信號通路的下游分子，介導IL-22的產生及腸屏障的維持。CARD-9基因缺陷小鼠發生結腸炎的風險增高，可能與缺少代謝色氨酸的腸道細菌有關[21]。

2.2 腸黏膜免疫細胞遷移至肝臟可加重肝病進程 腸道淋巴細胞歸巢(gut lymphocyte homing)可引起肝臟的炎癥損傷。已知腸黏膜淋巴細胞表達整合素α4β7和驅化因子受體CCR9，可分別與內皮黏附分子MAdCAM-1和趨化因子CCL25結合。一項研究指出，在炎癥性肝臟疾病，包括PSC患者，肝竇內皮細胞過量表達MAdCAM-1和CCL25，募集腸道來源的淋巴細胞進入肝臟，引起肝臟損傷[22]。在機制上，肝臟血管黏附蛋白(vascular adhesion protein, VAP)-1與肝臟MAdCAM-1過量表達相關，VAP-1的底物半胱胺來源于腸菌代謝及飲食，通過門脈進入肝臟后作用于VAP-1[23]。此外，研究者通過測序發現腸道T細胞TCRβ鏈克隆可能與肝組織來源相關，可能識別同一種抗原。除T細胞外，B細胞也參與“腸肝對話”[24]。研究表明，肝內產生IgA的B細胞亞群來源于腸道淋巴樣組織，可識別腸道共生菌抗原[25]。鑒于慢性肝病，如PBC和PSC患者血清IgA水平較高，腸道產生IgA的B細胞可能由細菌活化后進入肝臟，進而參與了上述疾病的發病過程。

2.3 部分腸菌代謝物調節肝臟免疫有望緩解肝病 BA為“腸肝對話”的重要組成部分。在生理狀態下，肝細胞將膽固醇作為原料來合成初級BA，后者與甘氨酸或牛磺酸結合后進入膽道、儲存于膽囊。在進食狀態下，BA進入小腸以促進脂肪的吸收。大部分BA在回腸末端被重吸收，通過全身血液循環回到肝臟，其余BA則在腸菌膽酸鹽水解酶(bile salt hydrolase，BSH)作用下形成游離BA，再通過7-α脫羥基酶的作用形成次級BA，通過門脈回到肝臟，BA的代謝過程受到調控，其中法尼酯X受體(farnesoid X receptor, FXR)和G蛋白偶聯膽汁酸受體1(G protein-coupled bile acid receptor 1, TGR5)受到廣泛關注。FXR位于腸上皮細胞，與BA結合后，啟動成纖維細胞生長因子19(fibroblast growth factor 19，FGF19)的轉錄過程。FGF19通過門脈進入肝臟，通過抑制肝細胞CYP7A1酶，可下調BA水平，維持肝臟穩態。一方面，可改善參與BA代謝的腸道菌群以恢復正常的肝臟免疫能力。研究表明，應用特定抗生素組合殺死部分革蘭氏陰性菌后，初級/次級BA比例達到平衡，進而上調肝竇內皮細胞趨化因子CXCL16水平、促進CXCR6+NKT細胞聚集于肝臟，可抑制腫瘤生長[26]。另一方面，可改善BA的信號通路來治療膽汁淤積性肝病。奧貝膽酸(obeticholic acid, OCA)作為FXR激動劑，可用于對UDCA部分應答的PBC患者。一項關于OCA雙盲、對照的三期臨床試驗納入217例患者，歷時12個月，結果顯示OCA能顯著改善對UDCA部分應答的PBC患者血生化指標[27]。

色氨酸作為常見蛋白類食物中的必需氨基酸，經由腸道細菌代謝后，生成一系列吲哚衍生物，包括吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丙酸等。這些衍生物是芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)的配體。AHR被激活后，促進抑炎因子，如IL-10的生成，有利于維護腸屏障的完整性。此外，色氨酸衍生物能進入肝臟，調節脂質代謝、減輕炎癥反應。研究表明，部分AIH患者AHR通路受抑制或非經典通路被激活，導致Treg細胞/Th17細胞比例失衡，影響其上調免疫調節分子CD39的能力。通過活化AHR途徑，有望改善AIH患者的免疫微環境[28]。此外，短鏈脂肪酸(short chain fatty acid, SCFA)[29]、亞精胺(spermidine)[30]、氧化三甲胺(trimethylamine-Noxide，TMAO)[31]及新發現的氨基戊酸類代謝物TMAVA[32]，通過調控免疫和代謝等機制，影響多種疾病的發生發展。它們在自身免疫性肝病發病過程中是否發揮作用，有待進一步探索。

3 總結與展望

隨著高通量測序技術的迅速普及和不斷完善，自身免疫性肝病患者腸道微生態特征得以被揭示，但主要集中在前期的相關性研究。這些發生改變的腸道微生物在疾病發病機制中扮演的角色有待后續的因果性研究來進一步闡明。值得一提的是，目前熱點多聚焦于細菌，鑒于腸道微生態還包括真菌和病毒等，相關系列研究的完善才有助于全面揭示腸道微生態的變化。靶向腸道微生態包括應用抗生素、糞菌移植、益生菌、噬菌體等逐步精準化的治療手段，有望緩解自身免疫性肝病的進程。