膽汁酸在膽汁淤積性肝損傷發病中的作用研究進展

何勝夫 綜述，汪余勤 審校

膽汁淤積是指肝內外各種原因導致的膽汁形成、分泌和排泄障礙進而導致膽汁不能正常進入十二指腸而反流入血的病理狀態[1，2]。病程早期可無明顯癥狀而僅僅表現為血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和γ谷氨酰轉肽酶(gamma-glutamyl transferase，GGT)水平升高。在4660例慢性肝病患者中，膽汁淤積發生率高達10.3%[3]。膽汁酸在該病理過程中發揮著重要作用，膽汁酸是由膽固醇在肝臟內經過一系列生化反應而合成的兩性分子，初級膽汁酸在肝臟合成后經膽管分泌入腸道，在腸道細菌的作用下合成次級膽汁酸[4]，膽汁酸作為一種信號分子廣泛參與人體內多種代謝及激素信號通路[5,6]。研究發現，將體外培養的肝細胞置于高濃度具有潛在毒性的膽汁酸中培養會誘導肝細胞凋亡[7]。在膽汁淤積性肝病患者，血清炎癥因子水平升高[8]。在膽管結扎(bile duct ligation, BDL)小鼠，也能夠檢測到中性粒細胞的活化及其在肝臟的聚集[9]，表明炎癥反應是膽汁酸淤積時導致肝損害的重要因素。

1 膽汁酸循環及膽汁酸轉運體

膽汁酸合成包括經典通路和非經典通路兩種途徑。經典通路是以肝細胞內質網中的膽固醇7-羥化酶(cholesterol 7-hydroxylase, CYP7A1)為主要限速酶催化發生；非經典通路則發生在巨噬細胞及其他組織中，以定位于線粒體的甾醇27A羥化酶(sterol 27A-hydroxylase, CYP27A1)和定位于內質網的氧甾醇和類固醇7-羥化酶(oxysterol and steroid 7-hydroxylase, CYP7B1)為主要限速酶發生的。在經典通路中，膽汁酸的合成受法尼醇受體X(farnesoid X receptor, FXR)負反饋調控[10]。膽汁酸在肝臟合成之后大部分通過肝細胞表面的膽汁酸轉運蛋白-膽鹽輸出泵(bile salt export pump, BSEP)運輸至膽小管，小部分膽汁酸可以通過分布在肝細胞的多藥耐藥相關蛋白2(multidrug resistance-associated protein，MRP2)排泌至膽小管然后儲存于膽囊之中。當進食過后，膽囊收縮將膽汁酸排泄至腸道，其中95%膽汁酸在回腸中通過小腸刷狀緣細胞表面的Na+依賴的膽汁酸轉運體(apical sodium dependent bile acid transporter, ASBT)以及位于小腸上皮細胞基底膜的有機溶質轉運體和異源二聚體(organic solute transporter and Hhterdimer, OSTα/β)主動吸收至門靜脈[6，11]。膽汁酸經血液循環到達肝臟后被肝細胞基底膜的膽汁酸轉運體主動攝取，包括鈉離子/牛磺膽酸共轉運蛋白(Na+taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)、有機陰離子轉運蛋白(organic anion transporting polypeptide, OATP)家族[12]。其中，NTCP幾乎負責攝取所有的結合性膽汁酸，并受核受體法尼醇受體X以及SHP(FXR/SHP)調控[13]。OATP主要負責攝取非結合性膽汁酸，其主要受核受體FXR、孕固烷X受體(pregnane X receptor, PXR)等調節。膽汁酸循環中任一環節受損均可能導致膽汁淤積性肝損傷的發生。

2 膽汁酸并非通過其毒性直接誘導肝細胞凋亡

既往的觀點認為，各種因素導致膽汁淤積時，高濃度膽汁酸是通過其固有的溶解細胞膜毒性作用而直接導致肝細胞調亡。在這些研究中，研究者是將肝細胞置于高濃度次級膽汁酸中培養，然而在膽汁淤積患者體內，這些次級膽汁酸濃度很難達到上述實驗水平[14]。隨后，有學者提出在膽汁淤積性肝損傷患者中，是由于膽汁酸誘導肝細胞凋亡[15]，但是在BDL小鼠模型以及膽汁酸培養的體外人肝細胞，尚未發現肝細胞凋亡[16,17]，表明膽汁酸在膽汁淤積性肝損傷過程中可能是通過其他機制發揮作用的。

3 膽汁酸通過炎癥反應導致肝細胞損害

3.1 膽汁酸介導相關炎癥因子表達進而誘導中性粒細胞浸潤 在小鼠模型中可以觀察到在BDL 6小時后肝實質壞死區域有中性粒細胞大量聚集，與肝細胞損傷的起始時間一致，并且該研究還發現中性粒細胞的浸潤持續整個膽汁淤積病理過程[14,18]。相關實驗發現將小鼠肝細胞置于200μM的牛黃膽酸(TCA,小鼠主要內源性膽汁酸)中體外培養，可顯著刺激一系列細胞因子和黏附分子mRNA水平升高，包括CD18、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、巨噬細胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein-2，MIP-2)等[18-21]，并且有發現，膽汁酸誘導的炎癥因子表達增加與NTCP有關，因此認為膽汁酸通過NTCP介導進一步誘導炎癥因子表達上調[21]，而在膽汁酸轉運體NTCP缺乏的膽汁淤積患者中發現，盡管患者血清膽汁酸濃度很高，但其肝損傷卻很輕[13]。將人肝細胞置于病理濃度(>50μM)的甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)中體外培養，炎癥因子，諸如MCP-1、CCL15、CCL20、CXCL1、IL-8等表達上調[7]。此外，在敲除炎癥因子CD18或MCP-1基因后，研究者觀察到雖然BDL小鼠血清膽汁酸濃度極高，但其堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平較對照組小鼠降低，并且肝細胞損傷也明顯減輕[9,21,22]。同樣的，研究者在TCA中培養的小鼠肝細胞中發現早期生長反映因子-1(early growth response protein 1 EGR-1)表達上調，EGR-1是一種轉錄因子，其可調節包括炎癥因子在內許多基因的表達，并且當EGR-1缺陷時，膽汁酸介導的炎癥因子及細胞黏附分子釋放減少，中性粒細胞浸潤程度下降，肝細胞損傷明顯減輕[7,23]。此外，研究者發現在BDL小鼠模型中，小鼠肝內皮細胞以及肝實質細胞中細胞黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達明顯上調，ICAM-1作為一種細胞黏附分子可以促進中性粒細胞向病變區域遷移，因此可誘導中性粒細胞在肝臟受損區域大量浸潤，并且其表達上調強度與肝損傷程度相關[24]。細胞黏附分子ICAM-1和ERM蛋白(ezrin/radixin/moesin，埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白)以及Na+/H+轉換調節因子-1(NHERF-1，可以影響ERM以及ICAM-1的表達[25,26])形成的大分子復合物(ICAM-1/ERM/NHERF-1)在BDL小鼠肝臟中表達增加，他們認為該大分子復合物與BDL小鼠肝臟中性粒細胞浸潤有關，而且在NHERF-1缺陷的BDL小鼠模型中，小鼠肝臟內中性粒細胞浸潤顯著減輕。并且他們證實NHERF-1缺陷的BDL小鼠較對照組小鼠的血清谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)水平低70%，并且其肝細胞損傷也明顯減輕[26]。通過上述一系列實驗證明，膽汁酸可通過誘導BDL動物模型中一系列炎癥因子的釋放從而促進中性粒細胞在肝臟聚集，進而導致肝損傷。

3.2 其他免疫細胞的作用 除了中性粒細胞之外，其他免疫細胞也同樣參與膽汁淤積過程中膽汁酸介導的肝損傷。庫普弗細胞(Kupffer cell)—是肝臟中的巨噬細胞，在膽汁淤積性肝損傷過程中同樣發揮作用。既往將巨噬細胞分為兩型—M1和M2[27]，其中M1型Kupffer細胞為促炎表型，能被某些病理因素如細菌脂多糖、毒素等誘導釋放炎癥因子如IL-6、TNF-α等，從而導致肝臟損傷。而M2型Kupffer細胞為抗炎表型，其可選擇性被IL-4以及IL-13激活，并且釋放IL-4、IL-10、IL-13以及轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)而促進損傷修復并且抑制肝纖維化，從而減輕肝臟損傷[28]。Kupffer細胞具有極強的可塑性，在病理過程中能夠整合多種信號進而根據肝臟微環境的變化迅速改變其表型[29]。TGR5是一種G蛋白偶連膽汁酸受體，其廣泛表達于Kupffer細胞、膽管上皮細胞以及肝竇內皮細胞，可被膽汁酸如石膽酸(LCA)、脫氧膽酸(DCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)等激活[30]。巨噬細胞中TGR5被膽汁酸激活后，可以抑制炎癥細胞因子的表達而加強抗炎細胞因子的表達進而影響Kupffer細胞表型的轉變[31]。在肝臟受損病理過程中，Kupffer細胞還能夠通過吞噬凋亡細胞和細胞碎片，抗原呈遞以及招募其他免疫細胞發揮其作用[28,32]。除巨噬細胞外，T細胞同樣在膽汁淤積性肝病過程中發揮作用，IL-17是一種促炎以及成纖維細胞因子，由Th17細胞分泌，在BDL動物模型中已經證實可見Th17細胞以及IL-17的增加[33]。既往有研究表明，在原發性膽汁性肝硬化(PBC)小鼠模型中，自然殺傷T細胞(NKT Cell)能夠加重肝損傷[34]，而隨后相關研究表明，NKT細胞可通過刺激抗炎因子IL-6或抑制Kupffer細胞釋放的促炎因子而減輕膽汁淤積性肝損害[35]。近期，研究者發現，在恒定自然殺傷細胞(iNKT Cell)缺陷的小鼠模型中，炎癥因子CXCL-10、ICAM-1釋放減少，EGR-1表達下調而膽汁酸轉運體MRP2和NTCP的表達上調進而導致在BDL動物模型中膽汁酸介導的肝損傷明顯減輕，證明NKT細胞在膽汁酸介導的肝損傷病理過程中同樣發揮重要作用。

3.3 膽汁酸介導的炎癥信號通路 如前文所述，在膽汁淤積性肝病過程中膽汁酸通過誘導相關炎癥反應導致肝損傷，而膽汁酸是如何誘導炎癥反應發生的呢？Woolbright et al就此提出炎癥信號通路假說，他們認為膽汁酸可誘導一系列促炎信號級聯反[18]。既往已有研究證實，TCA可以通過一系列信號通路上調EGR-1的表達進一步促進炎癥因子MCP-1、MIP-2以及ICAM-1的 釋放，而這一過程并不需要FXR參與，這證實膽汁酸介導炎癥反應過程中部分是依賴EGR-1進行的，而這一過程涉及特定炎癥信號通路的激活。鞘氨醇1-磷酸受體2(sphingosine1-phosphate2 S1PR2)是膽管細胞中主要表達的鞘氨醇1-磷酸受體，Wang et al 研究人員發現在BDL動物模型中，TCA可以通過S1PR2激活ERK1/2/AKT-NF-κB信號通路進而誘導諸如MIP-2等炎癥因子釋放以及一系列炎癥反應進而加重肝損傷。Toll樣受體9(Toll-like receptor9 TLR-9)是細胞內的一種DNA受體，相關學者研究發現膽汁酸可以損傷線粒體，線粒體損傷后釋放的線粒體DNA(mtDNA)可激活TLR-9，而在敲除TLR-9的小鼠肝臟細胞中，膽汁酸誘導趨化因子MIP-2的作用明顯減弱。而且在敲除髓樣分化因子88(MyD88)及Trif因子的小鼠模型中，膽汁酸誘導炎癥因子表達的作用同樣也會減弱[14]，而MyD88以及Trif是TLR-9的下游信號分子，因此可以推測在在膽汁淤積性肝損傷中，膽汁酸誘導肝細胞損傷釋放mtDNA后激活TLR-9信號通路，進而導致下游信號分子激活增加炎癥因子的釋放從而加重肝損傷。綜合上述研究證明，在膽汁淤積性肝損傷過程中，膽汁酸可通過多種促炎信號通路介導肝細胞損傷。然而目前許多炎癥信號通路尚不清楚，仍需進一步研究發現。

4 膽管上皮細胞的參與

膽管上皮細胞是排列在膽管管壁內的上皮細胞，其同樣在膽汁酸介導的膽汁淤積性肝損傷過程中發揮重要作用。膽管上皮細胞上存在許多膽汁酸轉運體(如TGR5、ASBT、OSTα、OSTβ等)。如前所述，TGR5可在膽管上皮細胞細胞中表達，研究發現膽汁酸濃度升高時可誘導膽管上皮細胞中TGR5被激活并促進膽管細胞增殖并且可以抑制膽汁酸介導的細胞損傷。膽汁酸轉運體ASBT同樣在膽管上皮細胞中表達，當發生膽汁淤積時，膽管上皮細胞中ASBT表達上調，導致膽汁酸攝取增多進而導致肝臟內膽汁酸濃度上升，而近年來研究發現當發生膽汁淤積時抑制膽管上皮細胞中ASBT可顯著降低膽汁酸濃度并減輕肝細胞損傷。此外，膽管上皮細胞還能表達和分泌骨橋蛋白(osteopontin，OPN)，OPN是一種多功能蛋白，它能夠與炎癥細胞上的整合素受體結合成為許多免疫細胞(如中性粒細胞、NKT細胞、Kupffer細胞)的趨化因子。當發生膽汁淤積時，膽管上皮細胞中骨橋蛋白表達水平增高，而且對于敲除OPN的BDL小鼠模型中中性粒細胞浸潤明顯減輕，炎癥反應也明顯減輕。

5 膽汁淤積性肝損傷的治療

對于膽汁淤積性肝病尚無特別有效治療措施，熊去氧膽酸(ursodesoxycholic acid,UDCA)和S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAMe)仍是目前治療膽汁淤積性肝病主要藥物[2]。奧貝膽酸(obeticholic，OCA)—主要用于治療臨床UDCA應答不敏感的原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者，已于2016年由美國食品和藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準上市。而中草藥作為我國傳統醫學中的瑰寶近年來已被多項實驗發現對于膽汁淤積性肝病的治療具有一定效果。膽汁淤積時小檗堿(berberine,BBR)已被證實可通過增加NTCP表達促進膽汁酸的攝取進而恢復膽汁酸循環穩態。薯蕷皂苷(dioscin)則能增加膽汁淤積過程中膽汁酸轉運體MRP2、BSEP、NTCP的表達維持膽汁酸循環穩定從而減輕肝細胞損傷，并且它可以減輕肝臟炎癥反應，減輕氧化應激以及發揮抗纖維化作用。柯里拉京(corilagin)可抑制EGR-1的表達進而抑制炎癥反應并降低膽汁淤積動物模型血清中總膽汁酸以及ALP水平，并且它還可以抑制NF-κB的表達進而減輕膽汁淤積性肝病中肝臟炎癥反應，這可能與抑制前文所述的炎癥信號通路相關。此外，橙皮油素、五味子乙素等均被發現對于膽汁酸介導的肝損傷有一定治療作用[3]，但這些中草藥的臨床應用仍需要進一步的實驗驗證。除傳統中草藥以外，還有許多新型藥物正處于研究當中，比如Tropifexor，它是一種高效的FXR受體激動劑，其可通過激活肝細胞中FXR表達進一步激活下游SHP表達進而誘導BESP表達從而降低膽汁酸的蓄積。非諾貝特(fenofibrate)是過氧化物酶體增值劑激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptors α，PPARα)激動劑，其可通過激活PPARα進一步抑制CYP7A1活性從而降低膽汁淤積時膽汁酸的合成，并且它可降低PBC患者血清ALP以及體內多種炎癥因子水平，這些新型藥物目前仍處于臨床試驗中，有望在將來為膽汁淤積性肝病提供新的治療方法。