Hippo通路在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用

洪瑩暉， 王 純， 葉明亮， 羅 杰， 劉佳良， 任 超， 藍(lán)偲瑜， 趙 秋， 常 瑩

武漢大學(xué)中南醫(yī)院 消化內(nèi)科， 湖北省腸病醫(yī)學(xué)臨床研究中心，腸病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430071

原發(fā)性肝癌的發(fā)生是多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，病毒感染、酒精、黃曲霉素、代謝綜合征等基礎(chǔ)疾病都能增加原發(fā)性肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)[1]。然而其具體的病理機(jī)制尚待完善。通常所說(shuō)的肝癌“三部曲”即：肝纖維化—肝硬化—肝癌，在原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，肝組織硬度是不斷增高的，硬度作為機(jī)械信號(hào)的一種，被證實(shí)在調(diào)控細(xì)胞增殖和器官的發(fā)育方面有重要作用，也是癌癥的重要“催化劑”[2]。同時(shí)，臨床上有部分患者的原發(fā)性肝癌缺乏肝硬化病理基礎(chǔ)，這其中的機(jī)制尚需深究。部分原發(fā)性肝癌的形成和發(fā)展過(guò)程中既有肝組織硬度的不斷增加，同時(shí)也有肝癌細(xì)胞在應(yīng)對(duì)逐漸硬化的組織微環(huán)境的病態(tài)響應(yīng)過(guò)程。細(xì)胞一直感受著外界施加的力，并通過(guò)調(diào)整細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號(hào)通路和分子的表達(dá)來(lái)適應(yīng)這些變化并生存下來(lái)，可以說(shuō)原發(fā)性肝癌在硬度中“孕育”，同時(shí)也在硬度中不斷“成熟”—獲得更強(qiáng)的“本領(lǐng)”如侵襲轉(zhuǎn)移，這一癌癥的特有表征，是晚期患者喪失肝移植手術(shù)治療機(jī)會(huì)的主要原因。

1 經(jīng)典Hippo通路

Hippo信號(hào)通路是細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的經(jīng)典途徑，由一系列的激酶組成，在促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等方面具有重要作用，已有文獻(xiàn)[3]報(bào)道Hippo信號(hào)通路能夠促進(jìn)包括癌癥在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生發(fā)展。Hippo信號(hào)通路主要是由哺乳動(dòng)物Ste20樣激酶1/2(MST1/2)、大腫瘤抑制基因1/2(LATS1/2)，YAP蛋白和(或)其旁系同源TAZ(也被稱(chēng)為WW結(jié)構(gòu)域，包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1)構(gòu)成[4]。Hippo途徑可以被多種異常信號(hào)激活，當(dāng)Hippo處于“活性”狀態(tài)時(shí)，MST1/2被磷酸化后活化LATS1/2，繼而磷酸化YAP/TAZ，從而使其失活被抑制，滯留在細(xì)胞質(zhì)中[5]。相反，當(dāng)激酶處于失活狀態(tài)時(shí)，YAP/TAZ去磷酸化易位至細(xì)胞核繼而啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄[6]。

YAP蛋白是Hippo通路的下游核效應(yīng)器，Hippo通路可以通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄共激活因子Yki，或其同源類(lèi)似物YAP/TAZ影響細(xì)胞的基因型。YAP作為Hippo信號(hào)通路的核效應(yīng)器的上調(diào)元件，是多種實(shí)體腫瘤包括肝癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié)[7]。已有文獻(xiàn)[8]報(bào)道，YAP/TAZ在腫瘤中的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，并且被認(rèn)為是大量實(shí)體癌癥如肝癌的促癌基因。WW結(jié)構(gòu)域是具有兩個(gè)高度保守的色氨酸結(jié)構(gòu)域，并有假設(shè)猜想其可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)之間的相互作用，不同物種YAP中的WW結(jié)構(gòu)域是保守的。據(jù)報(bào)道[9]，YAP1僅包含一個(gè)WW域，而YAP2由兩個(gè)WW域組成。之前的研究[10]對(duì)于這些結(jié)合域進(jìn)行了結(jié)合測(cè)定，并發(fā)現(xiàn)WW結(jié)構(gòu)域可以與WBP-1和WBP-2的PPXY基序相關(guān)聯(lián)。值得注意的是，YAP被鑒定為含有C末端轉(zhuǎn)錄激活域的轉(zhuǎn)錄共激活因子[11]。YAP C末端的四個(gè)氨基酸與蛋白質(zhì)中的PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用，這可能在調(diào)節(jié)YAP的亞細(xì)胞定位中發(fā)揮重要作用[12]。最近的一項(xiàng)研究[13]表明，YAP-TEAD異二聚體可以與Taiman、GAGA、AP-1及β-catenin轉(zhuǎn)錄因子相互作用，并共同調(diào)控下游基因的表達(dá)。YAP蛋白Ser127位點(diǎn)上的磷酸化與14-3-3蛋白相結(jié)合，并通過(guò)細(xì)胞質(zhì)螯合抑制其轉(zhuǎn)錄活性。磷酸酶，例如蛋白磷酸酶-1，可以使YAP Ser127脫磷酸化，從而促進(jìn)YAP的核積累并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性[14]。酪蛋白激酶1可以誘導(dǎo)YAP Ser381位點(diǎn)上的磷酸化并影響其穩(wěn)定性，隨后激活磷酸化的降解基序[15]。促生長(zhǎng)基因Myc、CycE、E2F1和細(xì)胞凋亡的抑制基因Diap1和BIRC3有助于YAP蛋白的活化和積累[16]。Wnt、Notch、EGFR、TGFβ和JAK-STAT信號(hào)通路的配體也已被確定為YAP蛋白的靶標(biāo)，可以影響組織生長(zhǎng)[16]。此外，據(jù)報(bào)道[9]，Hippo途徑的一組上游成分包括Merlin、Ex、Kibra、AMOTL2和LATS激酶在負(fù)調(diào)節(jié)YAP蛋白中起著至關(guān)重要的作用。

2 Hippo/YAP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失調(diào)是肝癌的早期參與者

在多種實(shí)體腫瘤中包括原發(fā)性肝癌、肺癌、乳腺癌等均發(fā)現(xiàn)了YAP的異常過(guò)度表達(dá)[17-18]。同時(shí)，YAP被列為確定原發(fā)性肝癌進(jìn)展的臨床標(biāo)志物。YAP的水平和肝癌患者的Gleason評(píng)分、血清AFP水平及侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)呈正相關(guān)[19]。目前YAP的過(guò)度激活如何驅(qū)動(dòng)肝癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制尚不完善，但是近期研究報(bào)道涉及以下兩種機(jī)制。

2.1 過(guò)度激活的YAP參與早期肝星狀細(xì)胞活化 肝纖維化是由于慢性持續(xù)的肝損傷信號(hào)導(dǎo)致的肝細(xì)胞死亡和再生重疊交織的肝組織進(jìn)行性改變[20]。慢性肝損傷已成為全球負(fù)擔(dān)，盡管在丙型肝炎、肥胖和代謝綜合征等引起的慢性肝臟疾病治療方面取得了較大進(jìn)展，但是在抗纖維化治療方面仍然存在很多困難[21]。肝星狀細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量沉積的主要來(lái)源，持續(xù)的細(xì)胞外基質(zhì)的膠原沉積導(dǎo)致肝臟硬度的持續(xù)變化[22]。Dupont等[23]發(fā)現(xiàn)在早期纖維化反應(yīng)期間，核效應(yīng)因子YAP作為機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中間介質(zhì)響應(yīng)細(xì)胞外機(jī)械信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。Mannaerts等[24]在纖維化的體外模型中發(fā)現(xiàn)，YAP很早就已經(jīng)被過(guò)度激活并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，激活下游轉(zhuǎn)錄因子TEAD1-4的表達(dá)；同時(shí)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，YAP對(duì)于早期肝星狀細(xì)胞的活化和沉默YAP帶來(lái)的抑制肝星狀細(xì)胞活化的藥理作用具有重要意義。細(xì)胞外基質(zhì)的積累促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化，而活化的肝星狀細(xì)胞導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)的硬化進(jìn)一步促進(jìn)YAP的活化，由此在YAP-細(xì)胞外基質(zhì)-肝星狀細(xì)胞之間形成的反饋通路，帶來(lái)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，最終導(dǎo)致了肝臟的不可逆損傷乃至肝癌的發(fā)生[23]。

2.2 YAP/TAZ促進(jìn)肝炎的發(fā)生和維持 肝纖維化主要是由于肝臟的慢性炎癥而引起，Kim等[25]發(fā)現(xiàn)在Mst1/2基因缺失的肝細(xì)胞中，單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein-1，MCP1)的表達(dá)高度上調(diào)，同時(shí)巨噬細(xì)胞大量浸潤(rùn)，而沉默YAP1則大大削弱了MCP1誘導(dǎo)肝臟炎癥和肝癌的形成；這一點(diǎn)也在Mst1/2敲除的小鼠體內(nèi)得到證實(shí)。同時(shí)，文獻(xiàn)[26]報(bào)道了在原發(fā)性肝癌中TAZ的表達(dá)和促腫瘤炎癥細(xì)胞因子IL-6的分泌密切相關(guān)，而IL-6/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路同時(shí)是慢性肝損傷的主要促炎因素之一。YAP/TAZ與肝纖維化的形成密切相關(guān)，并且是肝纖維化乃至肝癌的有力促進(jìn)劑。

3 Hippo通路與其他轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的串?dāng)_

3.1 TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為一把“雙刃劍”，在機(jī)體正常生長(zhǎng)、發(fā)育中參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡，發(fā)揮著重要的抑癌作用，而在癌癥形成之后的進(jìn)展期中成為癌細(xì)胞重要的“助推劑”之一。尤其癌癥的晚期階段，在誘導(dǎo)癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換和腫瘤的侵襲遷移中發(fā)揮重要作用。TGFβ在肝癌中顯著高表達(dá)，且表達(dá)水平與疾病的進(jìn)展、預(yù)后不良相關(guān)[27]。在肝臟疾病進(jìn)展的不同階段，TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路扮演的角色不同。TGFβ抑制惡變前肝細(xì)胞的紊亂增殖，在肝癌形成之后，它促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚和腫瘤的侵襲遷移。Hippo通路和TGFβ通路串?dāng)_的首次發(fā)現(xiàn)是關(guān)于YAP和Smad7的結(jié)合，從而抑制TGFβ通路的一部分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[28]。隨著纖維化程度的加深，在TGFβ靶基因增加的同時(shí)伴隨著Smad6/7的顯著降低。Smad7作為重要的TGFβ抑制因子在TGFβ通路活化之后的顯著降低可能與YAP的細(xì)胞質(zhì)定位有關(guān)。同時(shí)，YAP/TAZ缺乏的成纖維細(xì)胞在體外對(duì)于TGFβ刺激的反應(yīng)性明顯降低，其產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)明顯減少[29]。此外，YAP/TAZ還與多種其他的Smad蛋白結(jié)合，感受不同的調(diào)節(jié)因素通過(guò)不同的機(jī)制參與TGFβ的信號(hào)調(diào)控。YAP/TAZ調(diào)節(jié)Smad蛋白的亞細(xì)胞定位對(duì)于TGFβ通路功能的發(fā)揮必不可少，YAP/TAZ的磷酸化可以促進(jìn)Smad2/3的核積聚而激活下游通路[30]。

3.2 Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括CTNNβ1依賴(lài)性的經(jīng)典途徑和不依賴(lài)CTNNβ1的非經(jīng)典途徑。早在1988年就發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路的異常表達(dá)是肝癌發(fā)生過(guò)程中的早期事件并且與肝癌的侵襲遷移有關(guān)，其中非經(jīng)典途徑發(fā)揮的作用尚不明確[31]。經(jīng)典途徑的Wnt信號(hào)被激活后，細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin積聚后易位至細(xì)胞核，在細(xì)胞核中，其與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子、Pygo和轉(zhuǎn)錄共激活因子BCL-9/BCL9l形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，促進(jìn)下游基因的表達(dá)。Kim等[25]發(fā)現(xiàn)在albumin-Cre(Alb-Cre)Mst1-/-Mst2fl/fl突變體(以下簡(jiǎn)稱(chēng)DKO)小鼠肝臟中，Hippo信號(hào)通路中關(guān)鍵激酶MST1/MST2的缺失導(dǎo)致了肝細(xì)胞中經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。同時(shí)，在DKO小鼠中，β-catenin和YAP/TAZ之間的關(guān)聯(lián)在調(diào)控肝臟的大小和肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在雙雜交的β-catenin敲除的DKO小鼠中，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的小鼠YAP/TAZ蛋白水平明顯降低，同時(shí)其腫瘤負(fù)荷和腫瘤數(shù)目也明顯較少。此外，YAP/TAZ還通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中Dishevelled(Dvl)的磷酸化以及β-catenin的細(xì)胞質(zhì)定位來(lái)抑制Wnt /β-catenin的活性[16]。

4 microRNAs(miRNAs)對(duì)于Hippo/YAP通路的調(diào)控

miRNAs作為一類(lèi)21～25個(gè)核苷酸的高度保守的非編碼小核苷酸，主要通過(guò)識(shí)別靶基因的3′-UTR特定互補(bǔ)序列來(lái)降解或者抑制靶mRNA[32]。miRNAs幾乎參與了機(jī)體各種生理和病理過(guò)程，包括肝癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生發(fā)展。研究[33]發(fā)現(xiàn)miR-375通過(guò)靶向YAP1負(fù)向調(diào)控肝癌的發(fā)展。關(guān)于miRNAs調(diào)控LATS1的報(bào)道較少，可能是因?yàn)長(zhǎng)ATS3′-UTR的長(zhǎng)度明顯短于LATS2，因此LATS1不易被miRNAs靶向調(diào)控。miR-103直接抑制LATS2的活性使Hippo途徑失活而促進(jìn)肝癌的侵襲遷移[34]。在肝癌細(xì)胞系HepG2和Hep3B中，miR-186通過(guò)靶向YAP1抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[35]。此外，HBV編碼的反式激活因子preS2的過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制miR-338-3p上調(diào)TAZ從而促進(jìn)肝癌的增殖和遷移[36]。miR-29c-3p通過(guò)調(diào)控Hippo通路中的重要激酶LATS1的甲基化抑制肝癌的發(fā)展而成為可能的臨床治療靶點(diǎn)[37]。miRNAs影響Hippo通路中的重要激酶的激活/失活過(guò)程和核效應(yīng)器YAP的表達(dá)，從而廣泛參與到Hippo通路的調(diào)控當(dāng)中。

5 Hippo通路參與肝癌的藥物抵抗和侵襲轉(zhuǎn)移

索拉非尼作為治療肝癌的靶向藥物，其治療的晚期肝癌患者的中位生存期僅為12.4個(gè)月，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市的樂(lè)伐替尼治療肝癌患者的中位生存期僅為13.6個(gè)月[38-39]。目前對(duì)于索拉非尼很多患者已經(jīng)出現(xiàn)耐藥，盡管其中具體的耐藥機(jī)制尚未完全明確，但是耐藥的產(chǎn)生通常涉及藥物擴(kuò)散和進(jìn)入細(xì)胞的速率減慢以及細(xì)胞對(duì)于藥物敏感性的降低這兩個(gè)方面。已有文獻(xiàn)[19]報(bào)道在肝癌細(xì)胞株Huh-7中YAP的過(guò)表達(dá)明顯降低了索拉非尼對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，同時(shí)si-YAP組的裸鼠腫瘤重量明顯低于對(duì)照組。此外，在肝癌中機(jī)械信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)增加為促進(jìn)YAP入核的主要因素，研究[40]發(fā)現(xiàn)YAP通過(guò)RAC1-ROS-mTOR途徑抑制自噬相關(guān)的癌細(xì)胞死亡，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞株BEL-7402的多重耐藥性，且抑制YAP的Verteporfin(VP)聯(lián)用5-Fu實(shí)驗(yàn)組的裸鼠腫瘤重量和腫瘤負(fù)荷顯著低于僅給予5-Fu的對(duì)照組。在肝癌中，YAP通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的積聚影響藥物的擴(kuò)散速率和降低細(xì)胞對(duì)化療及靶向藥物的敏感性，進(jìn)而促進(jìn)耐藥的發(fā)展，給臨床治療造成了阻礙[20]。

6 總結(jié)

原發(fā)性肝癌作為最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一備受關(guān)注。肝硬化基礎(chǔ)之上發(fā)展的原發(fā)性肝癌肝組織中，硬度作為一種物理信號(hào)變化尤為顯著。Hippo通路是重要的細(xì)胞外機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在果蠅和哺乳動(dòng)物中高度保守。Hippo通路失調(diào)是原發(fā)性肝癌的早期事件，和TGFβ、Wnt等信號(hào)通路的串?dāng)_促進(jìn)肝癌的發(fā)展。YAP作為Hippo通路的核效應(yīng)器是原發(fā)性肝癌的預(yù)后標(biāo)志物，促進(jìn)肝癌耐藥。探究原發(fā)性肝癌中Hippo通路的作用機(jī)制，對(duì)于尋找新的原發(fā)性肝癌的治療方法具有重要意義。