微生物推動下的膠原生物工程發展現狀

董彥博，張正衍*，程 岳，馬識婷，吳 怡，艾力西爾·艾斯克爾，周亞麗，王 忠

（蘭州大學第二臨床醫學院，甘肅 蘭州 730030）

膠原蛋白是哺乳動物中含量最豐富的蛋白質，在細胞外基質的結構、分子和細胞相互作用中起著關鍵作用。膠原蛋白具有獨特的分子結構，即膠原三螺旋結構。這種結構由一個超螺旋的三螺旋組成，它是由三個左旋的聚線型鏈擰成一個右旋的三螺旋組成的。這種結構的另一個特點是，三螺旋的緊密排列要求一級序列中的每三分之一殘基為Gly，因為在三螺旋的內軸線上沒有任何較大的氨基酸空間。因此，膠原蛋白的第二個特征是重復氨基酸序列模式（gly-xaa-yaa）n[1]。另一個特點是，非甘氨酸的位置經常被亞氨基酸脯氨酸占據。對于動物膠原蛋白，yaa位置的pro殘基，約占所有殘基的10%，通常被prolyl-4-羥化酶（p4h）翻譯后修飾，得到4-羥脯氨酸（hyp）。這種修飾是非常重要的，特別是作為三螺旋良好熱穩定性的內在要求，同時也有助于膠原纖維的自締合，以及參與某些受體相互作用[2]。雖然膠原蛋白崽學術界被認為是一種物質，但在人體和其他哺乳動物中至少有28種基因的不同類型，它們都具有不同的結構特征。最豐富的膠原是形成膠原纖維的間質膠原，特別是I型膠原，存在于所有主要結締組織中。I型膠原是一種易于獲得和純化的膠原，已成為生物醫學和組織工程應用的主要膠原。利用重組技術生產膠原蛋白。重組技術不僅能夠生產出具有統一產品質量的無病產品，還可以產生不常見的膠原類型，而這些稀有的膠原蛋白從組織中直接提取并不實際。重組技術通過引入突變殘基、選擇特定結構域制備出具有多個重復基序的工程產品和嵌合結構，也有機會對天然蛋白質結構進行修飾和改進。然而，重組技術的潛在缺點是，重組膠原也需要功能性p4h的共同表達，以增強三螺旋穩定性。而p4h酶由兩種不同的鏈類型組成，每種鏈的分子質量約為65kda。如果膠原三螺旋的穩定性較低，則產品為變性膠原和明膠，明膠只有單鏈組成，無法折疊成天然的三螺旋結構。此外，雖然重組技術可以用于實驗室樣品的小規模生產，但對于商業規模的生產，仍然存在控制工藝和成本評估方面的問題。

此外，基于轉基因生物的其他系統也相繼出現。目前，利用轉基因小鼠生產膠原蛋白。另一個適合于纖維蛋白的系統是在轉基因家蠶的繭中生產重組人Ⅲ型前膠原。轉基因植物中的膠原蛋白生產也得到了發展，似乎提供了成本效益高、商業化的結果。最初的報告從種子中的發酵物中產生未經羥基化或羥基化不良的膠原蛋白。在生產系統中引入p4h對于優質的膠原蛋白產品是必要的。最近，利用p4h也產生了異源三聚體膠原蛋白，這種方法具有可商業化的前景。重組系統可能還有更多的優點，但目前依然停留在實驗室水平上。

重組細菌膠原：一個新興系統

膠原蛋白被認為與多細胞動物組織有關。在最近的一段時間里，在其他物種中出現了類膠原分子的發現，在一些真菌、病毒和噬菌體中存在（gly-xaa-yaa）n重復序列。然而，最有趣的是，在細菌和正在出現的大量細菌基因組中發現了許多類膠原結構。在化膿性鏈球菌中發現了一個具有膠原樣重復序列的基因，這是一種毒力因子。隨后，從同一物種中鑒定出第二個結構獨特的類膠原基因。生物化學和生物物理學研究表明兩者都具有典型的膠原三螺旋結構。

令人驚訝的是，這些膠原蛋白在哺乳動物體溫附近都是穩定的，融化溫度分別為36.4℃和37.6℃，不存在任何羥脯氨酸。

細菌膠原序列可能是真核生物水平基因轉移到細菌的結果。然而，無論基因起源如何，很明顯，一系列的結構、功能和分子相互作用已經進化并建立起來。對病原菌的少數類膠原結構進行了深入研究，表明膠原基序通常與細菌的外膜有關，并可能與宿主相互作用，以協助入侵或幫助病原體逃避宿主免疫系統。例如，這種結合可以是與整合素受體或其他細胞外基質分子的結合，介導病原體被人類細胞內化。

開發細菌膠原蛋白作為一種新的醫學材料的另一個好處是可以很容易地大量生產。毫無疑問，這部分是因為細菌膠原蛋白比人原纖維膠原蛋白序列短。據報道，使用高細胞密度策略和延長的24小時生產時間，化膿鏈球菌Scl2構建體的最高產量可達19 g / L。 該構建體包含N端非膠原結構域，但是這仍然給出了約14 g / L的膠原結構域計算產量。良好的發酵產量仍然需要與簡單有效的下游純化方案相匹配。 對于商業生產，實驗室純化方案（例如帶有His6-tag的固定化金屬親和色譜法和其他較小規模的色譜系統）不適用。總之，缺乏細胞毒性和免疫原性，生產和純化的容易性足以表明細菌膠原蛋白有望用于生物醫學材料。然而，重組技術也提供了機會，使結構易于適應以賦予確定的功能或新功能。一些細菌膠原蛋白已經鑒定出內源性細胞結合域。“空白”是指可以用一個或多個定義的功能來設計和制造分子。通過改變現有的螺旋結構域或通過插入額外的三螺旋基序，各種團體已經對此進行了探索。基于僅在人類I型膠原蛋白中發現的大量生物學域，更不用說在膠原蛋白中增加其他功能的機會了，更不用說從眾多其他膠原蛋白類型和相關的三螺旋蛋白中出現的生物學域了。另外，可以像其他蛋白質一樣，將非三螺旋結合基序（例如RGD）重組（或在整個化學過程中）添加到CL結構域的N端或C端。相似的非三重螺旋序列添加還允許開發具有定義的特定生物學功能的其他新分子。最近，已證明向化膿性鏈球菌CL結構域的C末端添加絲狀基序（GAGAGS）n能夠與絲質底物結合，從而提供了開發更復雜的復合結構的機會。

生物技術的一個關鍵考慮因素是，可以從新的細菌膠原基材料中開發出什么產品？像哺乳動物的膠原蛋白一樣，在生物醫學產品中肯定會有機會，將新的膠原蛋白用作涂層或制成特定的設備，以提供用于特定用途的增強產品。例如，作為涂層，細菌膠原可以被生物工程化以引入離散的整聯蛋白結合序列GLPGER，GFPGER或GFPGEN，以靶向特定的整聯蛋白結構域（α1I結構域或α2I結構域）。這樣提供的涂層基質可以區分內皮細胞和平滑肌細胞粘附，同時避免任何血小板凝集，而血小板凝集對于血管假體和其他心血管技術具有特殊的應用。如設計的生物活性水凝膠和其他形式（例如海綿）產生細菌膠原的能力進一步擴展了潛在的生物醫學和組織工程應用。最近的研究表明，當使用適當的穩定和干燥存儲策略時，也可以為此類產品獲得足夠的保質期。

總結與展望

除了重組技術和生物工程細菌膠原蛋白在生物醫學和組織工程應用中的前景的當前實例外，未來還會出現其他中藥的發展。但是內在穩定性的進一步增強是未來發展的重要突破點。這可能是由于發現了更穩定的分子（例如高穩定性，Tm = 42℃，在噬菌體膠原蛋白中發現了膠原蛋白）或通過對序列進行了修改而結合了對不同序列特征的現有理解而引起的，包括靜電相互作用，可以增強穩定性。增加穩定性的另一種選擇是添加Hyp，該產品目前未包含在大腸桿菌生產系統中。以前，已經提出可以通過向發酵培養基中加入修飾的氨基酸Hyp來實現，盡管摻入的效率可能受到限制并且對序列中的Yaa位置沒有特異性。然而，最近，已經描述了在大腸桿菌中發酵期間允許膠原結構域的Yaa-位置特異性翻譯后羥基化的系統，并且該系統對于短肽長度的膠原底物是有效的。這種方法對細菌膠原蛋白的使用可能會受到其較大尺寸和Xaa位置Pro比例較高的限制。 另一個潛在的發展領域是嵌合結構。 這些可能包括不同細菌膠原蛋白成分的復合結構，例如，使用不同物種的折疊結構和膠原蛋白結構域，或者使用不同膠原蛋白結構域，或者包含細菌膠原蛋白和不同蛋白質的構建體，例如絲綢，彈性蛋白 或其他膠原蛋白。還存在進一步使細菌膠原蛋白核心蛋白功能化的機會，以允許選擇性地對一種或多種肽或非肽分子之一進行簡單而復雜的束縛，以實現特定蛋白質材料的既定開發。

膠原蛋白在生物醫學設備中已經確立了重要地位，在生物醫學設備中，已經開發了包括制造的組織和可溶解的膠原蛋白格式在內的不同形式。這些產品已成功用于許多不同的臨床應用中。 然而，在某些情況下，例如用制造的基于組織的硬腦膜替代物，已經觀察到不幸的不良后果，在該示例中由于疾病傳播導致死亡。該示例以及疾病傳播帶來的其他潛在問題，意味著仍然需要考慮使用基于天然膠原的材料和設備。 在商業重組生產人類膠原蛋白方面已取得顯著進展。但是，已經在大腸桿菌中鑒定并產生重組非動物（細菌）膠原蛋白的快速興起的技術引入了令人興奮的新膠原蛋白選項，可以輕松地針對特定的生物醫學應用對其進行定制。這些定制的膠原蛋白將為在醫療設備，可植入材料以及潛在地用作干細胞支架等更多樣化的應用鋪平道路，僅舉幾例這些重組細菌膠原蛋白的用途。為了實現商業化，需要在中試規模（例如500 L批量）下進行高發酵產量和直接純化過程的未來演示，以顯示可擴展性和評估過程的經濟性。 中試規模的批次還將促進大量材料的生產，然后可將其用于一般動物模型中的更廣泛的生物學評估和應用開發，然后再定義用于特定生物醫學應用的功能性動物模型。