CRISPR/Cas9技術在心血管疾病動物模型的應用

陳慧玲 張然

(中國農業大學生物學院，北京 100193)

心血管疾病(CVD)在非傳染性疾病中死亡率居于首位，高于腫瘤及其它疾病，且目前CVD患病率仍處于持續上升階段。因此，CVD對人類健康構成極大地威脅。為了能更好地治療CVD，動物CVD模型便成為人類探索該領域的重要介質。由于缺乏有力的基因組編輯工具，CVD模型的構建較為困難，因而人們對CVD的研究進展緩慢。在20世紀90年代末，ZFNs編輯技術的開發開啟了第1扇定制核酸酶靶向基因組工程的大門。隨后第2代基因編輯工具TALENs被開發利用，然而，由于ZFNs和TALENs技術操作相對復雜，會影響其使用。2013年第3代基因編輯工具CRISPR/Cas9技術問世，徹底引發生物醫學研究領域新的革命。

1 CRISPR/Cas9技術

CRISPR/ Cas9系統包含1個gRNA，能夠將核酸酶Cas9定位于基因組中的特定位置。gRNA由Cas9結合所必需的短RNA序列和一段約20個核苷酸序列組成。Cas9核酸酶包含HNH核酸酶和類RuvC核酸酶結構域。其首先識別PAM序列，該序列為目標DNA的側翼序列。與PAM結合后，Cas9通過其HNH和RuvC催化結構域產生DNA雙鏈斷裂(DSB)，然后通過非同源末端連接(NHEJ)或同源重組修復(HDR)系統進行基因組修復。CRISPR/Cas9系統已經成為許多物種(如人類和小鼠細胞，斑馬魚等)中基因敲除和位點特異性敲除的新工具。

2 CRISPR/Cas9技術在CVD動物模型的應用

2.1 CRISPR/Cas9技術應用于動物CVD模型的構建

2.1.1 斑馬魚CVD模型的構建

斑馬魚胚胎幾乎是透明的，允許觀察內部結構而不需要侵入性的儀器。特別是心臟和血管很容易通過顯微鏡觀察到，這使得心臟收縮、血流、血管大小和模式的連續可視化和量化成為可能[1]，而且斑馬魚與人類之間遺傳關系較強，且分子信號通路顯著相關，使得斑馬魚成為模擬復雜發育過程的有用工具。因此，許多科研工作者選用斑馬魚研究不同基因突變致CVD的機理。血漿低密度脂蛋白膽固醇升高是動脈粥樣硬化和心血管疾病發生的主要危險因素，而LDL受體(LDLR)缺陷是人類家族性高膽固醇血癥的主要原因。近年來，通過使用CRISPR/Cas9方法獲得ldlr突變斑馬魚模型，在正常飼喂條件下，斑馬魚發展為中度高膽固醇血癥；在采用高膽固醇飼喂5d后加重斑馬魚的高膽固醇血癥和血管脂質沉積[2]。利用CRISPR/Cas9系統構建GTPBP3敲除斑馬魚，結果顯示，GTPBP3基因缺失導致線粒體功能障礙，致使產生肥厚性心肌病表型，重現攜帶GTPBP3突變的HCM患者的臨床表型[3]。

2.1.2 小鼠CVD模型的構建

CRISPR/Cas9系統已然成為制作遺傳工程小鼠當下最流行的編輯工具，能夠直接應用于胚胎。來自賓夕法尼亞大學的研究人員發現，血友病B家族在F9基因中攜帶一個新的突變Y371D，利用CRISPR/Cas9系統產生了不同的轉基因小鼠模型，并證實了新的Y371D突變導致的血友病B表型比Y371S突變更為嚴重。該研究首次開發出一種雙基因療法，其能夠將CRISPR/Cas9介導的基因靶向系統的關鍵組分運輸到小鼠機體中來治療B型血友病[4]。此外，Caroll等人已經培育出只在心肌組織特異表達的Cas9轉基因小鼠，并通過將靶向Myh6的sgRNA 裝載在AAV載體上注射入小鼠，實現Myh6的敲除，導致小鼠心臟功能受損和明顯肥大[5]。因而CRISPR/Cas9系統可以探索心臟特異表達基因在心臟功能和發育中的特定作用，并有效糾正出生后/成年小鼠的遺傳缺陷。

2.1.3 豬CVD模型的構建

豬和人的心血管系統在冠狀動脈血管的大小、分布、血壓、心率、心臟指數和最大氧氣消耗等方面表現出相似之處，且具有相似的藥物藥代動力學。因而豬是研究人類CVD的重要模型。Huang等人利用CRISPR/Cas9系統同時靶向巴馬小型豬載脂蛋白E (ApoE)和低密度脂蛋白受體(LDLR)基因，成功獲得雙等位基因敲除豬。該基因修飾豬的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、載脂蛋白B(APOE)水平明顯升高[6]。Fang等人構建的ApoE -/-豬在常規飼喂條件下血漿膽固醇水平適度升高，但在高脂高膽固醇(HFHC)飲食6個月后，出現嚴重高膽固醇血癥，并在主動脈和冠狀動脈中出現類似人的動脈粥樣硬化病變[7]。這些模型對CVD的研究和相關轉化研究具有一定參考價值。

2.1.4 非人靈長類CVD模型的應用

NHPs基因組的精確修飾對生物醫學研究的發展具有巨大推動力。然而NHPs具有性成熟時間長、繁殖率低、繁殖困難等特點，傳統育種產生雙等位基因突變NHPs，以進行功能缺失的研究非常具有挑戰性。近年來，利用CRISPR/Cas9技術進行基因編輯使這一過程變得較為容易。目前利用CRISPR/Cas9技術，通過合子注射，已成功構建p53突變體猴，該模型對壓力超載期間p53誘導的炎癥如何導致心功能障礙，以及p53誘導的心血管細胞衰老為何促進動脈粥樣硬化發生的研究具有重要意義[8,9]。

2.2 CRISPR/Cas9技術在CVD治療中的應用

雖然針對CVD的藥理學和侵入性治療可以達到減輕癥狀和延緩疾病進展的目的，但目前仍然需要其它治療方法來有效治療甚至治愈CVD。AAV-CRISPR/Cas9成為研究者的首選。AAV是單鏈(ss)DNA載體，具有良好的安全性，能夠在包括心臟在內的多種靶組織中實現持久地轉基因表達。目前AAV-CRISPR/Cas9已用于緩解兒茶酚胺敏感性多形性室性心動過速(CPVT)、DMD等小鼠模型和DMD豬模型的病癥。CPVT常由RYR2的功能獲得性突變所引起，為實現長期有效地治療CPVT，研究者給P10 Ryr2R176Q/+小鼠皮下注射AAV9-CRISPR/Cas9 5～6周，該系統能夠在體內有效破壞心肌細胞中Ryr2突變等位基因，且接受AAV-CRISPR治療的R176Q/+小鼠未出現心律失常[10]。對3月齡mdx小鼠尾靜脈注射SERCA2a AAV9載體，阻止其擴張型心肌病的發展[11]。AAV9-Cas9-gE51處理DMDΔ52豬模型恢復其心臟抗肌營養不良蛋白的表達，延長其壽命，減少心律失常的易感性[12]。這些結果證實，通過AAV-CRISPR/Cas9傳遞系統進行體內基因編輯可能是治療CVD的一種有效治療方法，同時有可能改善藥物的療效。

3 CRISPR/Cas9技術的局限性

CRISPR/Cas9工具雖能緩解心血管疾病模型癥狀，但其也是一把雙刃劍，高編輯效率成為其直接應用于人臨床治療的一大障礙，使其在整個基因組的脫靶位點均可能發生突變。HDR能夠在基因組中引入特定的突變，然而HDR只在S期或G2期的增殖細胞中起作用，而NHEJ在細胞周期所有階段不同類型的細胞都能發揮作用。因此目前運用CRISPR/Cas9技術通過HDR校正成熟的心臟和血管組織致病突變較為困難。

有望克服上述局限性的技術是體內單堿基編輯器的使用。單堿基編輯器是被修飾過的CRISPR/Cas9工具，能夠改變單個堿基對而不發生DSB，如BE3僅能引起單鏈斷裂，并與胞嘧啶脫氨酶結構域連接，該結構域能夠在切口處將胞嘧啶轉變為尿嘧啶。目前已有研究通過腺病毒載體分別將BE3遞送入Pcsk9突變和ANGPTL3突變小鼠體內，結果發現，經治療后小鼠血漿膽固醇水平顯著下降[13,14]。然而單堿基編輯器僅限于點突變的產生，無法實現基因的敲除，而且較大的組分難以包裝成病毒顆粒。

綜上所述，CRISPR/Cas9技術已廣泛應用于基因功能研究和多種動物疾病模型的構建，并且作為一種治療手段，該技術在動物模型上的可行性和有效性也已被研究。雖然CRISPR/Cas9技術也有其不可避免的局限性，如脫靶問題較為嚴重，但是現如今世界科技水平日益增強，基因編輯技術的發展如此迅猛，相信不久的將來科研人員能夠將現階段基因編輯工具存在的缺陷逐步解決，未來能夠直接應用于人類CVD的治療。