基因探針技術在食品衛生檢測中的應用分析

胡云軒，楊土保

（中南大學湘雅公共衛生學院，湖南 長沙 410008）

人類食品必須具備的條件除本身的營養價值外，還不應對人體產生毒害作用。食品衛生檢測目的是及時檢測出食物有害部分，可分為生物性危害、有害化學物質、物理性污染三方面的檢測，其中歸屬于生物性危害的病原性微生物是食品安全最大危害。傳統病原性微生物檢測基本通過物理方法（顯微鏡技術、染色技術等）與生化方法（淀粉水解試驗、甲基紅試驗等）[1]進行，成本要求高、效率低、速度緩慢、部分有害物質難以檢測[2]。基因探針技術作為現代社會食品衛生檢測技術的一種手段，不僅克服了傳統的食品衛生檢測中的不足，還具有強特異性、高靈敏度等優點。

1 基因探針技術的食品衛生檢測原理

基因探針技術又稱DNA探針技術[3]、分子雜交術，可用來檢測食品中有害微生物。堿基互補配對條件下的核酸雜交是主要的檢測原理，經過處理的兩條堿基互補的DNA鏈在合當條件下按互補配對原則，人工形成雜交DNA分子。由于病原性微生物的形態和特性很大程度由基因決定，每種病原微生物都有獨特的DNA序列排序，將某種病原微生物進行基因標記制成標記性基因探針（如用32P同位素標記、生物素標記等），根據堿基配對，通過考察待測樣本與標記性基因探針能否形成雜交分子，就可以判斷樣本中是否含有此種病原性微生物（目前大腸桿菌、李斯特氏菌、葡萄球菌等較為常用[4]）。通過測定放射性的強度，還可以間接考察樣品微生物的具體數量。

2 基因探針技術的進展

自1975年Southern第一次提出基因探針雜交技術以來，該技術成為現代生物學衛生檢測中的重要技術手段。目前基因探測手段分為兩類[5]：一種稱為異相雜交技術或固相雜交技術（常見有Southern印跡法、非放射性DNA探針、DNA生物傳感器探針等）；另一種稱同相雜交技術或液相雜交技術（常見有雙探針常規技術、分子信標探針等）。

2.1 異相雜交技術

異相雜交也被稱之為固相雜交，主要在溶液環境中進行，參與反應的DNA一條單鏈以游離的形態存在于溶液中，另一條單鏈固定于固相支持物（硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等）上，在檢測過程中，與底物相結合的單鏈被固相支持物固著，未與底物結合的單鏈在溶液中洗脫。一旦反應產物固著，則不易洗脫，因而在食品衛生檢測中最為常用。異相雜交技術的印跡法是最早的基因探針雜交技術，最早由同位標記法記錄。隨著技術的進展，更多食品衛生檢測逐漸采用放射性探針。放射性強度越強，檢出陽性率越高，檢測結果也就越好。

基因生物傳感器探針技術是近些年發展的基于基因探針技術與生物傳感器技術的新手段。基因生物傳感器探針技術的原理是把基因探針固定在物體的表面，通過適當的傳感器與信號放大裝置，將反應轉變成可定量的電、光等物理信號從而能夠進行食品衛生檢測與監控[6]。

2.2 同相雜交技術

同相雜交技術也被稱為液相雜交，與異相雜交相比不需要固定基因、刪除沒有雜交基因等操作。同相雜交的兩個標記探針主要在溶液中與目標基因雜交，根據分子量的不同通過平衡密度梯度離心分離雜交體，從而得出檢測結果。但是雜交完成后未互補配對或操作失敗的成分混雜于液相中，導致最終結果準確度與精確度不高[7]。

分子信標探針技術是近年來的熱門話題，其主要原理是熒光共振能量轉移，在探針末端進行熒光標記，只有完全互補的基因才可以與分子信標探針進行雜交，由此可見分子信標探針技術具有非常高的特異性[8-9]。

2 PCR技術與探針檢測技術聯合

PCR技術又被稱之為聚合酶鏈式反應技術，經過多年的研究發展運用到食品安全與食品衛生檢測的領域當中[10]。PCR技術通過變性、退火、復火、延伸四個步驟可以大量拷貝出食品致病菌的某一特定基因排列順序。該技術只需要很少量的待檢測微生物，就能擴增出滿足實驗檢測需要的片斷以進行定性定量分析，因此，PCR的技術常常與DNA探針技術聯合運用。利用PCR的技術可以大大提高基因探針技術在食品衛生檢測中的靈敏度。將其用做食物中少量病原微生物的檢測技術手段，大大提高了基因探針技術在食品衛生檢測中的應用。但是PCR技術對實驗室的精密度與操作人員的業務能力有著很高的要求，涉及操作復雜，技術含量高，現階段無法大范圍普及。

3 基因探針技術在食品衛生檢測中的應用

3.1 基因探針的構建

近年來基因探針技術在食品衛生檢測中起了重要作用[11]，目前基因探針技術可以用來檢測食物中含有的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶希氏菌、李斯特菌等。基因探針構建的成功與否很大程度決定實驗是否失敗。在食品衛生檢驗中，微生物種屬所特有的基因序列（也被稱為特異性保守序列）是探針構建的關鍵，該基因序列的保守性有利于提升檢測的精確性。

3.2 基因探針的優點

傳統微生物檢測方法一般涉及對病原微生物的培養、形態學以及理化特性的分析，在多年實際運用中已經證明其具有一定的有效性與特異性，但病原微生物的生存條件、生長速度、檢測方法固有缺陷使其運用范圍局限。由于需要對病原微生物的人工培養，所以傳統檢測方法局限于已知種類的微生物，對未知病原微生物的培養具有著盲目性。基因探針技術與之相比，不僅僅能克服以上所述傳統微生物檢測方法的不足，還可與PCR技術、生物芯片技術、免疫酶聯技術等多種新技術等相結合，大幅度提升了檢測的靈敏性、特異性，運用范圍也大幅度地拓寬。

3.3 注意事項

為了確保食品衛生檢測的準確度，一定要根據確定具體的檢測目標，制造不同基因探針。建立檢測食品衛生中微生物基因探針的基礎原則用來檢查微生物的排列標準和順序，并以特異性的保守基因排序作為基因目標，把這種排序的互補基因作為雜交探針技術。對于一些微生物來說，可以把微生物特有的生理基因變化來決定獨特排列的基因探針技術。例如和其他的微生物比較，大腸桿菌具有葡糖苷酸酶的特異性，可用來檢測食品中含有的總大腸桿菌數量，從而檢測食品衛生情況。

3.4 基因探針技術在食品檢驗中的應用成果

①美國Gene-Trak公司開發出檢測食品中大腸桿菌的商品級基因探針系統，先聯合PCR技術擴增目標DNA片段，達到檢測數量級后即可基因探針檢測，該系統無需傳統微生物培養，可快速精準完成檢測。②Moseley利用生物標記克隆沙門氏菌DNA片段作為基因探針，檢測飲用水、食物、飼料中的沙門菌屬。③對于不同種類大腸桿菌，如ETEC、EHEC、EPEC等，最新研究通過其特有的產毒基因序列、腸出血基因序列、致腸病基因序列的基因探針的精細構建，可用于鑒別。

3.5 存在的問題

①在基因探針的構建方面：若用同位素進行標記，需考慮同位素的半衰期以及放射性核素對人體的影響，尤其是食品領域，更需要進一步完善；若用生物素標記，在紫外線下容易分解，尤其食品領域中內源性生物素化蛋白和糖蛋白常引起背景加深與一系列非特異反應。②在基因探針的特異性方面，該技術更適用于已知序列的病原微生物，若病原微生物未知，檢測有很強盲目性。③在實際運用中，菌落雜交的敏感性也受菌落雜交的影響，同時對技術人員、實驗環境要求高，廣泛運用受限，需要更加精細的技術支持。

現階段傳統方法仍在食品衛生檢測中最常用，存在著成本較高、浪費時間較長等問題。有些微生物不能人工進行培養或者培養條件苛刻、生長周期長的特性使利用微生物傳統檢測方法在食品衛生檢測中困難重重，越來越多的問題急需解決。例如使用葡糖苷酸酶鑒別檢測大腸桿菌是現在日本和美國常用的檢測食物衛生標準的方法，但多次檢測已發現幾種因基因突變而產生的假陰性衛生檢測結果。社會發展對食品衛生檢測提出了強特異性、高靈敏度和操作簡單、節省時間等方面的要求。基因探針技術在食品衛生檢測中的應用具有重大的現實意義。