通絡止痛方對人膝骨關節炎滑膜炎性細胞TLR的影響*

楊黎黎，王慶甫

（1．北京市隆福醫院骨科，北京 100010；2．北京中醫藥大學第三附屬醫院筋傷科，北京 100029）

膝骨關節炎（KOA）是一種老年人中常見的退行性疾病，以關節軟骨變性，滑膜炎癥、關節軟骨下骨的變化為主要特點[1-2]。雖然有很多導致KOA發生的因素，包括關節損傷、遺傳、肥胖、老化、生物力學和炎癥等[3-4]，但其發病機制復雜，至今尚未完全清楚。人工關節置換術（TJA）是一種有效的治療晚期骨性關節炎的治療方法。然而，該方法伴隨著相應的風險，如感染、假體周圍骨折、下肢深靜脈血栓形成、關節脫位等。因此，繼續深入研究骨關節炎發病機制，有助于尋找新的治療靶點和治療方法，具有重要的臨床和臨床研究的重要作用。TLR2、TLR4是Toll樣受體（TLR）家族重要成員，在促炎癥因子、基質金屬蛋白酶等導致的骨關節炎軟骨退變病理進程中起重要的介導作用,對軟骨細胞凋亡、細胞外基質代謝失衡具有關鍵作用。通絡止痛方是治療KOA的經驗方，具有通絡止痛，活血化瘀的功效，通過超聲促透外治法治療KOA可有效減輕患者疼痛、改善膝關節功能[5]。但其作用機制尚不明確，本實驗將不同濃度通絡止痛方作用于人KOA滑膜炎癥細胞，通過對Toll樣受體通路的影響，探討該方的作用機制，為其治療KOA提供支持。具體報告如下。

1 材料和方法

1.1 組織來源 人KOA炎性滑膜組織源于北京中醫藥大學第三附屬醫院行關節置換治療的KOA患者廢棄滑膜組織。無菌條件下將取得的滑膜組織去除脂肪、纖維等，加入PBS洗滌，PBS清洗兩次后放在無菌小青霉素瓶中用解剖剪切碎成糊狀。置于2 mL 0．4%Ⅰ型膠原酶的25 cm2培養瓶中消化2．5 h（期間搖勻數次）。經200目金屬篩過濾。取未黏附的細胞移至離心管中，用2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基,反復吹打后將細胞接種在25 cm2的培養瓶中，置于37℃，5%CO2培養箱中。1～2 d換液1次，選取3～4代細胞，純度大于98%，經鑒定后用于實驗。

1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清，購自四季青公司；RPMI-1640培養基、胰蛋白酶-EDTA消化液（0．25%）、Ⅰ型膠原酶，均購自Gibco公司；PE-anti-human-TLR4、FITC-anti-human-TLR2，美國 eBioscience公司；Trizol，美國Sigma公司；RNA逆轉錄試劑盒（TOYOBO），SYBR Green Real-time PCR Master Mi ×（TOYOBO），5 ×LoadingBuffer（TAkara），DNA MARKER B（上海生工）；發光液，普利萊基因技術公司；羊抗兔 IgG／HRP，美國 Sigma公司；TLR4 抗體，abcom；TLR4引物均由北京百諾威生物科技有限公司出品；流式細胞儀，美國BD公司FACS Calibur；4℃低溫高速離心機，美國Thermo；ELX800型酶聯免疫檢測儀，美國生物技術儀器公司；CO2培養箱，美國Thermo Scientific;四環凍干機，北京四環科學儀器廠有限公司。

1.3 藥物制備及劑量 通絡止痛處方組成：桂枝100 g，白芍 60 g，桃仁 50 g，紅花 50 g，制草烏 10 g，細辛 3 g，川椒 20 g，牛膝 20 g，乳香 30 g，沒藥 30 g；購于北京中醫藥大學第三附屬醫院藥房。將上述中藥飲片按成方比例置煎煮容器內，加水浸泡，煮沸30 min，棄藥渣取湯劑，經過離心機2 000 r/min離心，棄藥渣取湯劑，利用冷凍干燥機進行冷凍干燥，粉末狀，PBS溶解，用0．22 μm微孔濾器過濾除菌，配制成高、中、低濃度：高濃度組：2．5 mg/mL；中濃度組：0．25 mg/mL；低濃度組：0．025 mg/mL；對照組：0 mg/mL（培養液）。-20℃儲存備用。

1.4 觀察項目及檢測方法

1.4.1 流式細胞術（FCM）檢測細胞中TLR2、TLR4表達情況 1）采用細胞免疫熒光直接標記法，樣品中依次加入PE-抗人TLR4單克隆抗體和FITC-抗人TLR2單克隆抗體兩種熒光標記抗體，振蕩器充分混勻。2）室溫避光染色 15 min。3）1 500 r/min，離心6 min，如此反復PBS洗3遍，將細胞碎片及未結合的熒光標記抗體去除。將細胞密度調整為1×106個/mL上機。流式細胞儀檢測采用SSC和FSC設門，測定10 000個滑膜細胞中TLR4、TLR2陽性表達百分率，用 FACSDiva Version 6．1．3 軟件對數據獲取及分析。

1.4.2 實時定量熒光PCR檢測TLR4 mRNA的基因表達 將培養瓶從培養箱中取出，棄上清液，鋪板，加入不同濃度通絡止痛方，對照組加入培養液。繼續放入培養箱中培養過夜。用Trizol提取滑膜組織總RNA，檢測其純度及完整性后將RNA逆轉錄合成cDNA，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。將北京百諾威公司提供內參GAPDH及上下游引在樣品液中加入各1 μL，引物序列見表1。反應體系25 μL，經過 95 ℃預變性 2 min，95 ℃變性 30 s，60℃退火30 s，60℃延伸30 s，擴增35個循環后70℃延伸10 min進行熒光檢測，由電腦自動分析并計算出反應體系中待測樣品c DNA達到設定閾值的循環數（CT 值）并計算 2-ΔΔCT值，其中，ΔΔCT=（Cttarget-CtGAPDH）加藥組-（Cttarget-CtGAPDH）對照組。

1.5 統計學方法 應用SPSS 20．0軟件進行統計學處理。計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組數據采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞術（FCM）檢測細胞中TLR2、TLR4表達情況 高、中、低濃度通絡止痛方組TLR4表達率與對照組比較都有明顯的降低（P＜0．05）,且隨著濃度升高，TLR4的表達率逐漸降低；高、中、低濃度通絡止痛方組TLR2表達率與對照組比較差異無統計學意義（P＞0．05），見表 2。高、中、低濃度組通絡止痛方FSC-SSC散點圖圈定細胞圖與TLR2、TLR4的表達率流式圖見圖1～8。

表2 FCM檢測細胞TLR4及TLR2陽性表達百分率（±s） %

注：與對照組比較，*P＜0．05；與高濃度組比較，△P＜0．05。

組別 TLR4 TLR2對照組 52．8±1．21 0．3±0．08高濃度組 10．0±0．88* 1．6±0．43中濃度組 34．0±1．02*△ 0．5±0．19低濃度組 45．1±1．22*△ 0．2±0．06

2.2 實時定量熒光PCR檢測TRL4 mRNA的基因表達 與對照組比較，高、中、低濃度組中，人膝骨關節炎滑膜炎癥細胞TLR4的表達水平顯著降低（P＜0．05）。低濃度組通絡止痛方對滑膜炎癥細胞TLR4抑制作用與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0．05）。高、中濃度組抑制作用與濃度呈正比。結果見圖9。

圖1 高濃度組FSC-SSC散點圖圈定滑膜炎癥細胞

圖2 高濃度組TLR4、TLR2表達率流式圖

圖3 中濃度組FSC-SSC散點圖圈定滑膜炎癥細胞

圖4 中濃度組TLR4、TLR2表達率流式圖

圖5 低濃度組FSC-SSC散點圖圈定滑膜炎癥細胞

圖6 低濃度組TLR4、TLR2表達率流式圖

圖7 對照組FSC-SSC散點圖圈定滑膜炎癥細胞

圖8 對照組TLR4、TLR2表達率流式圖

圖9 不同濃度通絡止痛方對人膝骨關節炎滑膜炎癥細胞TLR4 表達的影響（±s）

3 討論

KOA屬中醫學的“骨痹”范疇[6]，是由多種因素引起的關節軟骨變性、破壞及增生和關節周圍軟組織炎癥等為特征的一種慢性關節疾病，老年人中常見病，嚴重影響著國民的生存質量。盡管如此，KOA發病機制還不清楚發病機制復雜，并且到目前為止，還沒有一種治療方法可以從根本上預防、改變或中止KOA的疾病進程[7]。人類TLR是一類信號轉導跨膜受體位于細胞表面，可對入侵病原微生物的識別在固有免疫中發揮重要作用。TLR家族可以按其細胞定位及配體分為兩個亞群，一種亞群分布于細胞膜表面，以外均識別以脂質為基礎的配體，包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、LR6 和 TLR10；一種亞群則識別以核酸為基礎分布在內體、溶酶體以及內質網等細胞器上的配體，包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR9。TLR4、TLR2是最早被發現的TLR家族成員，是介導天然免疫和炎癥反應的一種主要模式識別受體，在細菌感染和自身免疫性疾病中起重要作用。TLR4、TLR2是與骨關節炎最有關聯性TLRs的家族成員其中之一，同所知道的TLRs其他家族成員類似，TLRs啟動和激活的信號傳輸和誘導歸于常規Toll的樣信號路徑，能夠開啟NF-κB路徑和應激激酶路徑，激發炎癥因子包括白細胞介素（IL）－1β、腫瘤壞死因子（TNF）、蛋白聚糖酶（aggrecanases）、轉化生長因子 TGF、基質金屬蛋白酶（MMPs）等[8]，最終產生炎癥表現。它可以通過模式識別受體識別病原相關分子模式或內源性危險相關分子模式并與之結合后被激活。最近幾年來研究證實，固有免疫應答在誘發KOA滑膜炎癥反應中有著重要作用，TLRs介導的滑膜細胞固有免疫應答是促進KOA滑膜炎的關鍵環節[5-6]。

本課題組曾做過應用四甲基偶氮唑鹽法（MTT）法檢測不同濃度通絡止痛方對KOA滑膜細胞增殖活性的影響[9]。人KOA炎性滑膜組織源于本院行關節置換治療的KOA患者廢棄滑膜組織。原代培養細胞4 h可見細胞貼壁，見圖10，細胞成星狀，通過3～4條樹突與培養瓶相貼，細胞器不明顯，細胞密度稀疏。隨培養時間至3～4代細胞，見圖11，形態成滑膜成纖維細胞呈梭形、樹突樣，胞核狹長，增殖旺盛,細胞器可見。其形態特點符合滑膜炎癥細胞的形態學特點。將通絡止痛方分為高、中、低濃度，和空白對照組，高濃度組：10/42、10/43、10/44mg/mL；中濃度組：10/45、10/46、10/47 mg/mL；低濃度組：10/48、10/49、10/410 mg/mL；并設立空白組：0 mg/mL，應用MTT法檢測干預后KOA滑膜細胞的增殖水平，結果顯示，通過止痛方可以對滑膜成纖維細胞增殖產生影響，高中濃度組通絡止痛方抑制率為正值，隨濃度增加抑制率增大，低濃度抑制率為負值，隨濃度減低抑制率減少。在抑制率為正值的通絡止痛方濃度中將其按稀釋濃度比例分為高、中、低濃度組，為本實驗的研究濃度。

圖10 原代培養4 h貼壁KOA滑膜細胞

圖11 KOA滑膜3～4代細胞細胞

在探究通絡止痛方整體的作用機制方面。取全膝關節置換術患者術中廢棄滑膜組織培養成纖維細胞進行不同濃度濃度通絡止痛方干預，用以觀察通絡止痛方對人膝骨關節炎滑膜炎性細胞TLR4及1L-1β的影響，認為通絡止痛方可能通過Toll樣受體通路影響或抑制人膝骨關節炎滑膜炎性反應。還觀察通絡止痛方對人膝骨關節炎滑膜炎癥細胞上清1L-1β和TNF-α含量的影響，認為通絡止痛方對人膝骨關節炎滑膜炎癥細胞上清1L-1β和TNF-α有抑制作用，隨濃度增高，抑制程度越明顯。探討了通絡止痛方對人KOA滑膜成纖維細胞增殖的影響。認為高、中濃度通絡止痛方對滑膜細胞增殖有抑制作用，低濃度組的通絡止痛方對滑膜細胞有增殖有促進作用。

本實驗運用FCM，real-time PCR檢測技術驗證了通絡止痛方可以抑制Toll樣受體通路上重要成分TLR4、TLR2的表達，在一定程度上說明了通絡止痛方的作用機制，以及Toll樣受體通路在骨關節炎發生發展中的重要作用。KOA的病理發展是一個復雜的過程，并非一兩個細胞因子作用的結果，但是Toll樣受體通路有可能成為KOA診斷和治療的一項有用的指標，并且可能為KOA的治療提供一個新的靶點。通過通絡止痛方干預Toll樣受體的信號轉導通路或抑制其生物活性，將為治療骨性關節炎開辟一條新的途徑。