姜黃素對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控作用*

王 垚，付 新，張 聰，紀(jì)羽婷

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥化學(xué)教研室，哈爾濱 150040）

姜黃素（Cur）是從姜黃的根莖中提取的天然活性橙黃色結(jié)晶粉末，可調(diào)節(jié)多種信號(hào)分子，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物學(xué)活性[1]。姜黃素被證實(shí)可通過(guò)細(xì)胞因子、環(huán)氧合酶-2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、抗氧化應(yīng)激、NF-κB、過(guò)氧化物酶體增值物激活受體、絲裂原活化蛋白激酶、STAT3通路、Toll樣受體4等，被廣泛地用于治療各種疾病[2-3]。本實(shí)驗(yàn)利用TNBS復(fù)制UC小鼠模型，旨在探討不同劑量姜黃素治療結(jié)腸炎的療效及可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠72只，體質(zhì)量（20±2）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]。將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、姜黃素低劑量組、中劑量組、高劑量組、美沙拉嗪對(duì)照組，共6組，每組12只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后使用。

1.2 藥物及試劑 姜黃素購(gòu)自于南京廣潤(rùn)生物制品有限公司提供（批號(hào)：GR-133-140421）；美沙拉嗪購(gòu)自佳木斯鹿靈制藥有限公司葵花藥業(yè)生產(chǎn)（批號(hào)：130407）；三硝基苯磺酸（2，4，6，TNBS）相對(duì)分子質(zhì)量為293.17，購(gòu)自Sigma公司。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素（IL）IL-2、IL-4、IL-12P40、IL-15、IL-21 和 IL-23 等 ELISA 試劑盒均購(gòu)于ebioscience公司。

1.3 主要儀器 低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；酶標(biāo)儀（Molecular Devices SpectraMax Plus 384）；低溫高速離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5430R）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型復(fù)制 采用三硝基苯磺酸（TNBS）復(fù)制結(jié)腸炎小鼠模型[4]。造模前禁食12 h，除正常組外，所有小鼠給予1%戊巴比妥鈉溶液（5 mL/kg）肌肉注射麻醉后，按100 mg/kg TNBS計(jì)算，將其溶入0.15 mL 50%乙醇，配制TNBS乙醇復(fù)合溶液，用塑料軟管（直徑約為1 mm）將TNBS乙醇復(fù)合液注入距肛門約4 cm處，倒置小鼠5 min，使藥液送達(dá)結(jié)腸，然后將小鼠放回原籠中，待自然蘇醒，正常組注入等容積的50%乙醇TNBS誘導(dǎo)后24 h，隨機(jī)從模型組中挑選小鼠2只，麻醉后處死，如見(jiàn)小鼠結(jié)腸黏膜脫落，潰瘍形成，表面有污穢物覆蓋，充血水腫，提示造模成功。

2.2 給藥方法 自造模后1 d起，按體質(zhì)量換算，姜黃素低、中、高劑量組分別為50、100、200 mg/kg姜黃素，美沙拉嗪對(duì)照組給予300 mg/kg美沙拉嗪灌胃給藥，每日1次，共7 d。

2.3 動(dòng)物處理與病理學(xué)觀察 第8天，小鼠100 g/L烏拉坦麻醉后，脫椎處死小鼠。無(wú)菌分離結(jié)腸，測(cè)量結(jié)腸質(zhì)量和長(zhǎng)度之后，計(jì)算結(jié)腸重量指數(shù)（結(jié)腸重量指數(shù)=結(jié)腸濕重/體質(zhì)量×100%）。沿結(jié)腸縱軸剪開(kāi)，預(yù)冷生理鹽水清洗結(jié)腸內(nèi)容物。取部分結(jié)腸置于40g/L多聚甲醛溶液固定常規(guī)石蠟包埋切片5μm。HE染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定結(jié)腸組織液相關(guān)細(xì)胞因子水平 參照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)結(jié)腸組織勻漿中 GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-12P40、IL-15和IL-21的含量。待測(cè)上清液、標(biāo)準(zhǔn)品使用量均為50 μL，波長(zhǎng)450 nm下測(cè)定吸光度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18．0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況觀察 與正常組比較，模型組從第3天開(kāi)始，動(dòng)物均表現(xiàn)出不同程度質(zhì)量下降，神態(tài)呆滯、怕冷喜暗、體毛參差不齊、食量銳減、排便次數(shù)增多且溏稀，肛周污穢有脫肛狀，更甚者出現(xiàn)便血現(xiàn)象。與模型組比較，姜黃素組小鼠前期質(zhì)量也有下降狀況但趨勢(shì)較為平緩，后期趨向上升，稀便和血便程度明顯減輕，活動(dòng)量也隨之增加，情況趨于好轉(zhuǎn)。

3.2 姜黃素改善實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸黏膜損傷 HE染色比較結(jié)腸組織病理學(xué)形態(tài)改變。如圖1所示，正常組：腸壁完整，黏膜無(wú)缺損；模型組：黏膜脫落，潰瘍形成，黏膜下層血管充血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，大量壞死物質(zhì)形成；高劑量組：黏膜完整、未見(jiàn)明顯潰瘍，但腸壁增厚，血管擴(kuò)張，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；中劑量組：黏膜完整、未見(jiàn)明顯潰瘍，但黏膜下層充血水腫明顯，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；低劑量組：黏膜糜爛，可見(jiàn)小型潰瘍，黏膜下層充血水腫明顯，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；美沙拉嗪組：黏膜完整，上皮細(xì)胞增生，黏膜下層充血水腫，少量壞死物質(zhì)覆蓋表面。

如表1所示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)明顯升高（P＜0．05），結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短（P＜0．05）；而經(jīng)姜黃素治療后，與模型組比較，結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)顯著下降（P＜0．05 或 P＜0．01），而結(jié)腸長(zhǎng)度明顯延長(zhǎng)（P＜0．05 或 P＜0．01）；病理?yè)p傷評(píng)分，與正常組比較，模型組病理?yè)p傷評(píng)分顯著增高（P＜0．01）；與模型組比較，高、中、低劑量組和美沙拉嗪組病理評(píng)分都顯著增高（P＜0．05 或 P＜0．01）。

3.3 姜黃素對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織液相關(guān)細(xì)胞因子水平的調(diào)節(jié)水平 如表2、3所示，與正常組比較，模型組小腸組織液GM-CSF、IL-2、IL-12P40、IL-21 含量顯著升高（P＜0．05），IL-4、IL-15 和 IL-23含量顯著下降（P＜0．01）。與模型組相比，姜黃素各劑量組均可明顯降低小腸組織液GM-CSF、IL-2、IL-12P40、IL-21 含量（P＜0．05），IL-4、IL-15 和 IL-23含量顯著升高（P＜0．05）。

圖1 各組小鼠結(jié)腸病理圖片（HE染色，×200）

表1 各組小鼠的體質(zhì)量、腸質(zhì)量、結(jié)腸長(zhǎng)度、腸重指數(shù)及病理?yè)p傷評(píng)分（±s，n=10）

表1 各組小鼠的體質(zhì)量、腸質(zhì)量、結(jié)腸長(zhǎng)度、腸重指數(shù)及病理?yè)p傷評(píng)分（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0．05，#P＜0．01；與模型組比較，△P＜0．05，▲P＜0．01。

組別 體質(zhì)量（g） 結(jié)腸質(zhì)量（g） 結(jié)腸長(zhǎng)度（cm） 腸重指數(shù)（%） 病理?yè)p傷評(píng)分（分）正常組 23．12±1．31 0．19±0．02 7．50±0．11 0．79±0．08 2．14±0．26模型組 21．31±0．78* 0．23±0．02# 6．63±0．39# 0．98±0．06# 6．38±0．45#低劑量（50 mg/kg） 22．54±0．70△ 0．19±0．03△ 7．29±0．20▲ 0．79±0．10▲ 4．22±0．14▲中劑量（100 mg/kg） 21．97±1．09 0．18±0．03▲ 7．27±0．42△ 0．80±0．15△ 3．31±0．58△高劑量（200 mg/kg） 23．15±1．03▲ 0．18±0．02▲ 7．66±0．69▲ 0．78±0．11▲ 3．28±0．79▲美沙拉嗪 23．35±1．35△ 0．20±0．02△ 7．55±0．13▲ 0．83±0．08▲ 3．01±0．74▲

表2 ELISA測(cè)定小腸結(jié)腸組織液相關(guān)細(xì)胞因子水平（±s，n=10） pg/mL

表2 ELISA測(cè)定小腸結(jié)腸組織液相關(guān)細(xì)胞因子水平（±s，n=10） pg/mL

注：與正常組比較，*P＜0．05，#P＜0．01；與模型組比較，△P＜0．05，▲P＜0．01。

組別 GM-CSF IL-2 IL-12P40正常組 88．51±10．97 600．47±344．13 75．15±29．91模型組 173．83±20．12#902．04± 97．39*118．37±25．40*低劑量（50 mg/kg） 121．60± 6．04△ 692．54±112．31▲ 106．22±67．40中劑量（100 mg/kg） 110．15±28．64△ 719．22±180．16△ 65．63±51．43△高劑量（200 mg/kg） 120．81±12．38△ 667．51±177．00▲ 62．95±33．24△美沙拉嗪 115．11±15．83▲ 159．53± 23．05▲ 59．51±31．77▲

表3 ELISA測(cè)定小腸結(jié)腸組織液相關(guān)細(xì)胞因子水平（±s，n=10） pg/mL

表3 ELISA測(cè)定小腸結(jié)腸組織液相關(guān)細(xì)胞因子水平（±s，n=10） pg/mL

注：與正常組比較，*P＜0．05，#P＜0．01；與模型組比較，△P＜0．05，▲P＜0．01。

組別 IL-4 IL-15 IL-21正常組 123．82±30．75 392．27±77．27 409．95±213．95模型組 86．22±16．00#196．24±69．44# 11 797±145．22#低劑量（50 mg/kg） 108．52±19．67△ 280．66±22．06▲ 540．08±137．97▲中劑量（100 mg/kg） 111．90±18．72△ 297．36±46．35▲ 491．56±209．79▲高劑量（200 mg/kg） 115．63±33．56△ 307．42±63．40▲ 487．61±177．85▲美沙拉嗪 82．04±15．34 274．58±30．18△ 410．17±150．67▲

4 討論

本實(shí)驗(yàn)利用TNBS乙醇溶液成功復(fù)制實(shí)驗(yàn)性小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，與多數(shù)相關(guān)研究相似[5-6]，模型組小鼠結(jié)腸縮短，結(jié)腸重量增加、結(jié)腸重量指數(shù)和結(jié)腸鏡下病理?yè)p傷評(píng)分上升，結(jié)腸組織上清液中 GM-CSF、IL-2、IL-12P40、IL-21 的表達(dá)上升，而IL-4、IL-15和IL-23的量則是下降的；而經(jīng)姜黃素治療后，可明顯恢復(fù)結(jié)腸長(zhǎng)度，降低結(jié)腸重量、結(jié)腸重量指數(shù)、結(jié)腸鏡下病理?yè)p傷評(píng)分，提示姜黃素可有效治療小鼠結(jié)腸炎，同時(shí)姜黃素明顯降低結(jié)腸組織上清液中 GM-CSF、IL-2、IL-12P40、IL-21 的表達(dá)，同時(shí)升高IL-4、IL-15和IL-23分泌量。結(jié)腸炎癥發(fā)生時(shí)，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，促炎因子（如 GM-CSF、IL-2、IL-12P40、IL-21等）和抑炎因子（如IL-4、IL-15和IL-23）間平衡被打破，造成炎性損傷，故眾所周知，調(diào)節(jié)促炎與抑炎因子間平衡可明顯緩解潰瘍性結(jié)腸粘膜損傷[7-9]。這些促炎因子有的可與各種免疫細(xì)胞相結(jié)合，直接或通過(guò)協(xié)同作用造成炎性損傷。而在協(xié)同方面，GMCSF作為中性粒細(xì)胞集落刺激因子，可刺激中性粒細(xì)胞或抑制相關(guān)基因表達(dá)（如STAT3、STAT5等相關(guān)基因）的方式，促進(jìn) IL-2、IL-12p40、IL-21的分泌，形成協(xié)同創(chuàng)傷機(jī)制[10-11]。而抑炎因子（如IL-4、IL-15和IL-23等）雖也來(lái)源于T細(xì)胞，在不同程度上可分別拮抗IL-1β、IL-8和IL-21的分泌，也可以拮抗IL-12刺激T細(xì)胞分泌IFN-γ，拮抗IL-2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，對(duì)維持免疫平衡和穩(wěn)定起了關(guān)鍵性作用，在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過(guò)程中扮演了重要角色[12-13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)姜黃素治療后，結(jié)腸組織中 GM-CSF、IL-2、IL-12P40 和 IL-21 表達(dá)明顯降低，而IL-4和IL-15表達(dá)水平明顯升高，提示姜黃素可能通過(guò)減少GM-CSF表達(dá)水平，抑制中性粒細(xì)胞過(guò)度聚集，降低促炎因子IL-2、IL-12P40和IL-21表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)IL-4和IL-15等抑炎因子的產(chǎn)生，維持促炎因子與抑炎因子之間平衡，達(dá)到降低異常免疫反應(yīng)和減輕炎癥損傷的程度，起到治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的目的。然而姜黃素通過(guò)何種途徑抑制這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生及與免疫免疫細(xì)胞的作用，其協(xié)同創(chuàng)傷的機(jī)制與靶點(diǎn)是什么還不明朗，還有待于進(jìn)一步的完善。同時(shí)也注意到姜黃素治療炎癥性腸病是全方位多靶點(diǎn)，因此找到關(guān)鍵靶點(diǎn)和部位將是下一步重點(diǎn)工作。