苦參堿對CT26荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF及HIF-1α水平的影響*

龔 雪，崔換天，郭瑋鈺，王 麗，邊育紅，張翟軼

（1．天津中醫藥大學，天津 301617；2．天津市第二人民醫院，天津 300192）

近年來惡性腫瘤患病率持續升高，傳統治療手段（如手術、放療、化療）雖有一定優勢，但仍存在轉移、復發、生存質量降低等諸多問題。苦參堿是中藥苦參的主要成分之一，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等作用[1-3]。此外，苦參堿能減輕放療、化療的不良反應，減少腫瘤的復發和轉移[4]，提高患者生存質量，但其作用機制尚不明確。體外實驗研究表明，苦參堿對子宮內膜癌細胞、胃癌細胞的增殖有明顯的抑制作用[5-6]，且能降低腫瘤細胞中血管內皮生長因子（VEGF）的表達。而VEGF和缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）為血管生成的相關因子，其與腫瘤的發生發展密切相關[7-8]。臨床研究表明，子宮平滑肌腫瘤患者腫瘤組織中VEGF陽性表達率相較于癌旁組織顯著增加[9]。王秀巖等[10]發現膀胱癌患者中VEGF，HIF-1α 陽性表達率分別為 70．5%、57．2%，且兩者之間呈正相關。本研究通過建立結腸癌荷瘤小鼠模型，灌胃不同劑量苦參堿，研究苦參堿對荷瘤小鼠的治療作用，同時考察造模給藥后荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、HIF-1α表達，初步探究其作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及瘤株 Balb/c小鼠40只，雄性，體質量（20．0±1．0）g，由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養于SPF級清潔環境中，恒溫恒濕，標準飼料喂養，自由進食，常規適應性喂養7 d后開始造模給藥。小鼠結腸癌細胞株CT26（北納創聯生物技術有限公司）。

1.2 主要試劑及儀器 苦參堿標準品（C15H24N2O），分子量248．37（國家標準物質中心）；胎牛血清（Biological Industries，貨號：04-001-1ACS）；RPMI-1640 培養基（HyClone，貨號：SH30809．01）；雙抗（Gibco，貨號：15240-096）；0．25%胰蛋白酶（Gibco，貨號：25200-072）；總RNA提取試劑盒（天根生物科技有限公司，貨號：DP419-02），反轉錄試劑盒（天根生物科技有限公司，貨號：KR116-02）、熒光定量擴增試劑盒（天根生物科技有限公司，貨號：FP205-02）；兔抗鼠 VEGF（abcam，貨號；ab2349）、兔抗鼠HIF-1α（博奧森生物科技有限公司，貨號：bs-20399R），免疫組化二抗（博奧森生物科技有限公司）；多功能讀扳機（Thermo，型號：5250030）；光學顯微鏡（Olympus，型號：IX2-UCB-2）；熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（Bio-Rad）。

1.3 CT26細胞復蘇與傳代 CT26細胞1支，將細胞放入37℃水浴快速融化，用無菌操作法將細胞懸液轉移至15 mL離心管中，加入5 mL RPMI-1640完全培養液（RPMI-1640培養基+10%胎牛血清+1%雙抗），離心后將細胞重懸入5 mL完全培養液，接種至25 cm2瓶中，37℃，5%二氧化碳（CO2）培養。隔天換液，至細胞密度80%左右時，用胰酶消化傳代。

1.4 荷瘤小鼠模型建立及分組 選取Balb/c小鼠，雄性，體質量（20．0±1．0）g，分別于右腋下接種 0．2 mL經生理鹽水稀釋的CT26細胞懸液5×106個/mL，接種后培養21 d。將40只小鼠隨機分為模型組，陽性藥組，苦參堿低劑量組，苦參堿中劑量組，苦參堿高劑量組，于接種7 d后每天分別灌胃生理鹽水0．2 mL，環磷酰胺 25 mg/kg，苦參堿 12．5 mg/kg，苦參堿 25 mg/kg，苦參堿 50 mg/kg，連續灌胃 14 d[11-12]。

2 觀察指標及檢測方法

2.1 荷瘤小鼠一般情況、瘤質量及抑瘤率 各組小鼠均于第14天給藥2 h后，稱體質量，將小鼠頸椎脫臼處死，處死后剪開右腋下皮膚，分離腫瘤組織，盡量剔除骨頭及毛發，保證腫瘤組織的完整性，經生理鹽水沖洗后用濾紙吸干，稱質量，計算抑瘤率。抑瘤率=（模型組平均瘤質量-實驗組平均瘤質量）×100%/模型組平均瘤質量。

2.2 荷瘤小鼠腫瘤組織病理學變化 造模給藥后，收集各組荷瘤小鼠腫瘤組織，用福爾馬林溶液固定，常規脫水、透明、包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察各組荷瘤小鼠腫瘤組織病理學變化。每組6個樣本，每個樣本選取5個增殖最活躍區域，進行核分裂象計數[13]。細胞處于有絲分裂期的組織病理學特征為：核膜消失，染色體呈深染毛刺樣，對稱或不對稱分布于細胞質中，細胞質染色略淺。這樣的細胞記為1個核分裂象，計數時，在最活躍區連續計數10個高倍視野（400×），并將所得數值累加。

2.3 熒光定量PCR檢測 造模給藥后，收集各組荷瘤小鼠腫瘤組織，采用總RNA提取試劑盒（天根生物科技有限公司，貨號：DP419-02）提取腫瘤組織中RNA，使用UV法檢測每個樣品中的總RNA濃度。計算 OD260/280，OD260/280，選取比值在 1．8～2．0 內的樣本進行反轉錄合成cDNA（天根生物科技有限公司，貨號：KR116-02），擴增采用SYBR Green Real Time RT-PCR試劑盒（天根生物科技有限公司，貨號：FP205-02），運用qPCR法考察各組小鼠腫瘤組織中VEGF、HIF-1α基因表達，采用β-Actin為內參，具體引物序列見表1。

表1 引物序列

2.4 免疫組化造模給藥后，收集各組荷瘤小鼠腫瘤組織，用福爾馬林溶液固定，常規脫水、透明、包埋、切片，免疫組化法檢測各組小鼠腫瘤組織中VEGF（abcam，貨號：ab2349）、HIF-1α（博奧森生物科技有限公司，貨號：bs-20399R）的表達水平。VEGF定位于細胞質或細胞核，HIF-1α主要表達于細胞質中，細胞核中也有少量表達，鏡下觀察，圖片背景呈藍紫色，陽性產物呈棕黃色或黃色。400倍鏡下進行病理學觀察，每張切片隨機選擇不相重疊的5個視野，利用軟件（Image-pro Plus6．0）對陽性區域進行圖像處理，計算積分光密度（IOD）[14-15]，進行統計分析。

2.5 統計學方法 使用SPSS 21．0軟件對實驗數據進行統計學分析，計量資料服從正態分布采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗及LSD-t驗，P＜0．05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 苦參堿對結腸癌荷瘤小鼠的治療作用 各組小鼠在實驗過程中均未出現死亡。與模型組相比，陽性藥組（P＜0．01）、苦參堿低劑量組（P＜0．01）、苦參堿中劑量組（P＜0．01）、苦參堿高劑量組（P＜0．01）小鼠腫瘤重量顯著降低；與陽性藥組相比，苦參堿低、中、高劑量組各組瘤重差異無統計學意義（P＞0．05）。具體見表2。

表2 各組小鼠一般情況、瘤質量及抑瘤率比較（±s）

表2 各組小鼠一般情況、瘤質量及抑瘤率比較（±s）

注：與模型組相比，**P＜0．01。

組別 瘤質量（g） 抑瘤率（%）模型組 6．70±0．80 —陽性藥組 5．33±0．82** 20．44苦參堿低劑量組 5．27±0．94** 21．34苦參堿中劑量組 5．83±0．64** 12．99苦參堿高劑量組 5．60±0．66** 16．42 n 8 8 8 8 8體質量（g）24．15±1．41 22．44±1．35 23．20±1．42 24．34±1．27 24．92±1．76

3.2 給藥后各組小鼠腫瘤組織病理學變化 HE染色結果表明，模型組小鼠腫瘤組織中可見大量核分裂象，與模型組相比，陽性藥組、苦參堿低劑量組、苦參堿中劑量組、苦參堿高劑量組小鼠腫瘤組織中核分裂象顯著減少（P＜0．01），細胞壞死程度更為嚴重；而苦參堿高劑量組核分裂象與陽性藥組相比，差異具有統計學意義（P＜0．01）。以上結果提示苦參堿具有一定的抗腫瘤作用。具體見圖1、表3。

3.3 苦參堿對荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、HIF-1α mRNA表達水平的影響 熒光定量PCR結果顯示，各組小鼠腫瘤組織中VEGF在mRNA的表達水平差別有統計學意義（n=8，F=33．452，P＜0．05）。與模型組相比，陽性藥組（P＜0．01）、苦參堿低劑量組（P＜0．05）、苦參堿中劑量組（P＜0．01）、苦參堿高劑量組（P＜0．01）荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF在mRNA的表達水平均顯著下調，具體見圖2。

表3 各組小鼠核分裂象計數（±s）

表3 各組小鼠核分裂象計數（±s）

注：每高倍視野（HPF）直徑為 0．55 mm；與模型組相比，**P＜0．01；與陽性藥組相比，##P＜0．01。

組別 核分裂象個數（/10HPF）模型組 33．07±4．32##陽性藥組 14．13±3．03**苦參堿低劑量組 15．27±3．76**苦參堿中劑量組 13．33±3．96**苦參堿高劑量組 10．73±3．37**##

經不同劑量苦參堿干預后，各組小鼠腫瘤組織中HIF-1α在mRNA的表達水平差別有統計學意義（n=8，F=35．100，P＜0．05）。與模型組相比，陽性藥組（P＜0．05）、苦參堿低劑量組（P＜0．01）、苦參堿中劑量組（P＜0．01）、苦參堿高劑量組（P＜0．01）荷瘤小鼠腫瘤組織中HIF-1α在mRNA的表達水平均顯著下調，具體見圖3。

圖1 造模給藥后各組小鼠腫瘤組織HE染色（n=6，標尺：50 μm）

圖2 各組小鼠腫瘤組織中VEGF mRNA表達水平（n=8）

圖3 各組小鼠腫瘤組織中HIF-1α mRNA表達水平（n=8）

3.4 苦參堿對結腸癌荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、HIF-1α水平的影響 各組腫瘤組織免疫組化結果表明，VEGF陽性產物呈棕黃色表達于細胞質/細胞核中，見圖4。圖像分析結果顯示，與模型組相比，陽性藥組（P＜0．01）、苦參堿低劑量組（P＜0．05）、苦參堿中劑量組（P＜0．01）、苦參堿高劑量組（P＜0．01）VEGF的IOD值顯著降低，而苦參堿中、高劑量組的VEGF表達水平與陽性藥組相比，也具有統計學差異（P＜0．05），具體見表 4。HIF-1α 陽性產物呈棕黃色，主要表達于腫瘤細胞質中，細胞核中也有少量表達，見圖5。圖像分析結果顯示，各給藥組HIF-1α表達量較模型組均顯著降低（P＜0．05），而與陽性藥組相比，苦參堿低劑量組 IOD 值差異顯著（P＜0．05），具體見表4。

4 討論

現代藥理學研究表明，許多中藥的活性成分具有抗腫瘤作用[16]。苦參堿是中藥苦參中提取的一種生物堿，臨床常選取苦參堿/氧化苦參堿注射液治療消化系統腫瘤[17-18]。有臨床研究表明：苦參堿聯合化療治療晚期結腸癌療效顯著，能減少化療帶來的毒副作用[19]；與單純化療相比，采用復方苦參注射液聯合化療藥物可提高晚期結直腸癌的近期療效，改善患者生存質量[20]。苦參堿能抑制人結腸癌細胞株體外增殖，其機制可能與阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡有關[21]，且苦參堿能抑制K-ras基因突變型結腸癌細胞的生長[22]。苦參堿通過抑制p38信號通路抑制結腸癌細胞的增殖和侵襲[11]。除此之外，苦參堿對H22腫瘤細胞生長具有明顯的抑制作用，且能提高H22肉瘤小鼠的生存質量[23]。筆者研究發現，灌胃不同劑量苦參堿后，與模型組相比，結腸癌荷瘤小鼠腫瘤重量顯著減輕，腫瘤組織形態學有明顯改變，腫瘤組織中核分裂象顯著減少，提示苦參堿具有一定的抗腫瘤作用。

表4 各組小鼠腫瘤組織中VEGF及HIF-1α表達的比較[±s，IOD（×106）]

注：與模型組相比，*P＜0．05，**P＜0．01；與陽性藥組相比，#P＜0．05；與陽性藥組相比，##P＜0．01。

組別模型組陽性藥組苦參堿低劑量組苦參堿中劑量組苦參堿高劑量組n 3 3 3 3 3 VEGF HIF-1α 15．38±1．84## 18．06±1．34##8．37±0．84** 9．42±1．53**9．25±1．45* 14．01±1．02*#5．21±0．89**# 7．68±0．43**3．47±0．43**## 5．94±1．14**

圖4 給藥后各組小鼠腫瘤組織VEGF免疫組化染色（n=6，標尺：50 μm）

圖5 給藥后各組小鼠腫瘤組織HIF-1α免疫組化染色（n=6，標尺：50 μm）

臨床研究表明，結腸癌患者腫瘤組織中VEGF、HIF-1α水平較癌旁組織表達上調，二者均與結腸癌腫瘤直徑、TNM分期及分化程度有關[24]，VEGF表達水平與結腸癌病理性轉移密切相關[25]。腫瘤細胞生長需要大量的氧氣和營養物質以滿足其能量代謝和細胞增殖的需要，這個過程離不開血管生成，而VEGF是介導腫瘤血管生成的關鍵因素[26-28]，這對腫瘤的增殖、轉移十分重要[29]。已報道，某些中藥單體能通過調控VEGF/VEGFR2信號通路抑制結腸癌移植瘤血管生成[30]。HIF-1α是激活VEGF的一個關鍵轉錄因子，它位于多個促血管生成基因的上游[31-32]。當腫瘤細胞處于缺氧狀態時，細胞表達HIF-1α，HIF-1α能調控VEGF并使其表達上調，從而促進血管新生[33]。此外，腫瘤的缺氧狀態能幫助腫瘤細胞抵抗放療和化療所產生的細胞毒性[34-35]。

研究結果表明苦參堿可顯著降低荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白的表達，提示苦參堿可能是通過抑制荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF和HIF-1α表達從而發揮抗腫瘤作用。此外，本研究采用環磷酰胺作為陽性藥物進行比較，結果顯示苦參堿中、高劑量對結腸癌荷瘤小鼠腫瘤組織形態學影響與環磷酰胺處理無顯著差異，然而苦參堿能否作為環磷酰胺的替代藥物治療腫瘤有待進一步研究。