乳酸菌和酵母菌的添加對低鹽醬油品質的影響

張雁凌，張雁南，劉剛

(吉林工程技術師范學院 食品工程學院，長春 130052)

醬油是重要的調味品，由大豆、面粉、麩皮等原料經高溫蒸煮變性和微生物發酵作用分解為小分子物質，并通過各種化學反應形成，醬油是酵母菌和細菌等微生物綜合作用的產物，在發酵過程中產生的酶和代謝產物形成了醬油獨特的色、香、味成分[1]。在醬油發酵過程中，添加乳酸菌和酵母菌可以產生小分子醇、酸、酯、醛和酚等風味物質，形成醬油的風味[2]。嗜鹽四聯球菌是醬油發酵過程中的主要乳酸菌，其產生的有機酸可與酵母產生的醇類進行酸-醇酯化反應，形成濃郁的酯香，有效改善醬油的品質[3]。魯氏酵母廣泛應用于醬油發酵中，其發酵產生的醇類物質能與有機酸反應形成酯類物質，具有較高的風味貢獻能力[4-6]。

研究表明，食品中的高鹽已經成為誘發高血壓的主要原因之一，為此，有必要開發低鹽醬油以迎合人們的健康需求。低鹽醬油由于發酵過程中溫度較高，不利于微生物的生長繁殖，因而產生的醬油風味不足[7-8]。本文在低鹽醬油發酵工藝的基礎上，添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏接合酵母A22進行發酵，分析比較低鹽醬油添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏接合酵母A22前后理化指標、揮發性風味物質和生物胺的變化，為乳酸菌和酵母菌在改善低鹽醬油的品質方面提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉、嗜鹽四聯球菌TS71、魯氏接合酵母A22、甲醛、乙醇、重鉻酸鉀、葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸；Agilent 1200高效液相色譜儀、GC6890N-MSD5975氣相色譜-質譜聯用儀、PHS-25型pH計、HH-4數顯恒溫水浴鍋、HP-INNOWAX毛細管柱。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌和酵母菌的添加及低鹽醬油的發酵

將熟大豆、小麥面粉和大米淀粉按7∶1∶1的比例混合，接種0.2%的米曲霉，在30 ℃環境下培養2 d，隨后加入12%的鹽水混合制成醬醪。在醬醪中加入嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏接合酵母A22，在室溫下發酵3個月，發酵前和發酵過程中每月取出500 mL醬醪，無菌分離后用以進行分析測試。發酵完成后，過濾、離心取上清液，在80 ℃水浴中加熱20 min，分析醬油的物理化學性質，樣品記錄為LS-TA。采用同樣的發酵和取樣方法，以不添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏接合酵母A22制備的低鹽醬油作為對照,樣品記錄為LS。

1.2.2 常規指標和生物胺的測定

低鹽醬油中氨基酸態氮和總酸采用國標GB/T 18186-2000規定的方法測定，還原糖采用國標GB/T 5009.7-2008規定的方法測定，乙醇含量采用重鉻酸鉀比色法測定，總酯含量采用連續電位滴定法測定。生物胺濃度的測定采用高效液相色譜法。

1.2.3 揮發性風味物質的測定

采用GC-MS對低鹽醬油中的揮發性風味物質進行測定。氣相色譜條件：以He為載氣，流速1 mL/min，30 mm×0.25 mm毛細管柱，起始溫度40 ℃，保溫5 min，然后以5 ℃/min的升溫速率加熱至200 ℃后保溫15 min，再以10 ℃/min的升溫速率加熱至220 ℃后保溫5 min；質譜條件：電子能量70 eV，電壓350 V，電流200 μA，溫度200 ℃，掃描范圍30～350 amu。

2 結果與討論

2.1 低鹽醬油發酵過程中pH變化趨勢分析

LS和LS-TA在發酵期間pH的變化趨勢見圖1。

圖1 低鹽醬油發酵過程中pH變化趨勢Fig.1 Changes of pH during fermentation of low-salt soy sauce

由圖1可知，添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22對低鹽醬油發酵過程中的pH沒有明顯影響。醬醪發酵最初的pH值在6.7左右，發酵1個月后，由于碳水化合物發酵、氨基酸積累以及微生物細胞的自我分解，pH降低，繼續發酵，pH略有上升，醬油發酵結束后的pH保持在4.7左右。

2.2 低鹽醬油理化指標分析

添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22的低鹽醬油發酵結束后，取樣測定其氨基酸態氮、總酸、總酯、還原糖含量和酒精度，與未添加的低鹽醬油進行對比，結果見表1。

表1 LS和LS-TA低鹽醬油理化指標對比Table 1 Comparison of physiochemical indexes of LS and LS-TA low-salt soy sauce

由表1可知，低鹽醬油添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22后，總酸、總酯含量和酒精度明顯提高，分別由14.82 g/L，68.42 g/L，0.08%vol提高為18.91 g/L，81.66 g/L，1.89%vol，氨基酸態氮和還原糖含量無明顯變化。添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22后產生的醇類、酯類和有機酸類等物質增加了醬油的風味，相比未添加乳酸菌和酵母菌的低鹽醬油，香味更加濃郁，不良氣味有所降低。

2.3 低鹽醬油中的揮發性風味物質分析

表2 LS和LS-TA低鹽醬油揮發性物質對比Table 2 Comparison of volatile flavor components of LS and LS-TA low-salt soy sauce

續 表

由表2可知，添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22后，低鹽醬油的酸類、醇類、酯類、醛類、酚類等主要揮發性成分的種類和含量相比未作添加的低鹽醬油明顯不同，醇類和酯類物質在揮發性成分中的比例提高，酸類和醛類物質的比例降低。

2.3.1 酸類揮發性物質

未作添加的低鹽醬油存在醋酸、丁酸、戊酸、4-甲基戊酸和苯甲酸5種酸類揮發性物質，添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22后，醬油中的酸類揮發性物質種類和含量均發生了變化，檢測到7種酸類揮發性物質，新增了辛酸和癸酸，但酸類物質在揮發性成分中的占比相比未作添加時明顯降低，由13.81%下降為5.05%，其中醋酸含量變化最為明顯，由9.88%下降為3.27%，酸類物質含量降低表明在發酵過程中，酸類物質與酵母代謝產物發生了反應，揮發性酸類物質總量降低，使低鹽醬油的風味更為柔和[9-10]。

2.3.2 醇類揮發性物質

未作添加的低鹽醬油中檢測出7種醇類揮發性物質，分別為異戊醇、苯乙醇、糠醇、異辛醇、4-甲基-1-戊醇、1-辛烯-3-醇、3-甲硫基-1-丙醇，添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22后，總共的醇類揮發性物質仍為7種，新檢測出苯甲醇，未檢測出原有的異辛醇。添加乳酸菌和酵母菌后，低鹽醬油中醇類揮發性物質占比由44.16%增加到59.22%，醇類物質總含量明顯提高，其中苯乙醇含量由之前的2.14%增加為9.78%，3-甲硫基-1-丙醇由0.48%增加為0.69%。苯乙醇和3-甲硫基-1-丙醇是對低鹽醬油香味貢獻最大的兩種特征香氣，苯乙醇是由乙醇發酵時苯丙氨酸降解產生的，具有丁香、茴香、紫羅蘭等獨特香味，3-甲硫基-1-丙醇具有肉湯香味，在較低濃度時即有濃烈的香味。

2.3.3 醛類揮發性物質

醛類揮發性物質通常不是醬油的特征風味成分，但是醛類物質可以與醬油中的硫化物和醇類物質反應，提高醬油的風味。未作添加的低鹽醬油中檢測出6種醛類揮發性物質，分別為糠醛、苯甲醛、壬醛、苯乙醛、茴香醛和α-亞乙基-苯乙醛，添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22后，低鹽醬油中新增了肉桂醛。添加乳酸菌和酵母菌后，醛類物質在總的揮發性物質中占比由10.71%降低為6.42%。

2.3.4 酯類揮發性物質

未作添加的低鹽醬油中檢測出4種酯類揮發性物質，分別為乳酸乙酯、醋酸苯乙酯、甲烷硫代磺酸-S-甲酯和鄰苯二甲酸二異丁酯，添加乳酸菌和酵母菌后，除以上4種酯類揮發性物質外，還新增了苯乙酸乙酯和乙酸異戊酯兩種酯類物質。添加乳酸菌和酵母菌后，酯類揮發性物質占比由1.31%增加至12.65%，除新增酯類物質外，原有的酯類物質百分含量也顯著增加。未作添加時，低鹽醬油中未檢測到乙酸異戊酯，添加乳酸菌和酵母菌后，乙酸異戊酯含量增加為6.27%，醋酸苯乙酯含量從0.48%增加為5.86%。乙酸異戊酸和醋酸苯乙酯均具有新鮮果香味，提升這兩種物質的含量有利于改善醬油的風味。酯類揮發性物質含量的提高可以歸因于有機酸類與醇類的酯化作用，這種酯化作用主要由酵母發酵過程中產生的酯化酶引起。

2.3.5 其他揮發性物質

添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22后，低鹽醬油中其他揮發性物質的含量也發生變化，如愈創木酚等酚類化合物、呋喃等含氧雜環化合物、吡嗪等含氮化合物。相比未作添加的低鹽醬油，添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22后，低鹽醬油中的這些化合物的含量有所降低，但是由于這些揮發性物質的風味閾值非常低，含量的降低并沒有明顯影響醬油的香味。

2.4 低鹽醬油中的生物胺分析

生物胺廣泛存在于發酵食品中，正常濃度的生物胺有利于維持細胞正常的生理功能，但當人體攝入生物胺濃度過高時，可能導致惡心、呼吸紊亂等過敏反應，因此，控制低鹽醬油的生物胺含量尤為重要。通常要求醬油中生物胺的總含量不超過50 mg/kg，組胺含量不超過25 mg/kg。添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22的低鹽醬油與未作添加的低鹽醬油生物胺含量對比見表3，包括尸胺、腐胺、組胺和酪胺。添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22后，低鹽醬油中的尸胺、組胺含量由14.82 mg/kg和12.43 mg/kg分別增加到18.91 mg/kg和13.67 mg/kg，腐胺含量由11.29 mg/kg降低為4.12 mg/kg，酪胺含量由1.76 mg/kg降低為0.18 mg/kg，生物胺的總含量由40.3 mg/kg降低為36.88 mg/kg。添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22的低鹽醬油的組胺含量和生物胺的總含量均滿足要求。

表3 LS和LS-TA低鹽醬油生物胺濃度對比Table 3 Comparison of bioamines concentration of LS and LS-TA low-salt soy sauce mg/kg

3 結論

相比未作添加的低鹽醬油，添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22后發酵過程中pH變化趨勢不變，總酸、總酯含量和酒精度分別由14.82 g/L，68.42 g/L，0.08%vol提高為18.91 g/L，81.66 g/L，1.89%vol，氨基酸態氮和還原糖基本保持不變。揮發性風味成分分析表明，醇類和酯類揮發性物質占比升高，由原來的44.16%和1.31%分別提高至59.22%和12.65%，醛類和酸類揮發性物質占比降低，由原來的10.71%和13.81%分別降低至6.42%和5.05%。添加嗜鹽四聯球菌TS71和魯氏酵母A22后，低鹽醬油的生物胺由40.3 mg/kg降低為36.88 mg/kg。