漢麻葉黃酮成分及其抑菌活性分析

閆佳佳，萬璐，姜碩，許哲祥，鄭春英*

(1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080)

火麻仁，桑科植物漢麻(CannabissativaL.)的干燥成熟果實(shí)[1]，是著名的藥食同源功能性保健食品[2]。火麻仁油富含大量的不飽和脂肪酸、氨基酸、維生素、植物甾醇、CBD等酚類等成分[3]，是重要的調(diào)味品[4-5]。隨著對漢麻的深入研究發(fā)現(xiàn)，漢麻葉除了具有與火麻仁相關(guān)的活性成分外[6]，還富含大量非酚類活性成分，如：黃酮、生物堿等成分，這些成分具有潛在的活性研究價(jià)值和應(yīng)用前景[7]，關(guān)于漢麻葉所含黃酮、生物堿等非酚類成分的研究報(bào)道相對較少[8]。

眾所周知，黃酮類成分具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、保護(hù)心肌等作用[9]，是食品、藥品、功能性調(diào)味品的重要生產(chǎn)原料[10-11]。鑒于漢麻葉中含有豐富的黃酮成分，為了充分利用漢麻資源，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，本文選擇漢麻葉黃酮成分作為研究對象，擬對其進(jìn)行調(diào)味品方面的開發(fā)應(yīng)用。植物活性成分及活性作用受種植季節(jié)、生長環(huán)境、采收時(shí)期的影響而有所差異[12-13]，因此，選擇黑龍江漢麻葉中黃酮成分進(jìn)行分析，并進(jìn)行抑菌活性篩選，為開發(fā)新型保健食品及功能性調(diào)味品奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漢麻葉：龍大麻5號(hào)，產(chǎn)地黑龍江省孫吳縣；7種對照品(供含量測定用)：中國藥品生物制品檢定院；NA、NB培養(yǎng)基：配制方法參閱文獻(xiàn)[14]；供試菌共10株：購于黑龍江省微生物研究所，菌種現(xiàn)保存于黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥專業(yè)實(shí)驗(yàn)室；PDA培養(yǎng)基：配制方法參閱文獻(xiàn)[15]。

1.2 儀器與設(shè)備

FL2200型高效液相色譜儀 浙江溫嶺福立分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TLC法分析漢麻葉中黃酮類成分

對照品溶液的制備：參閱文獻(xiàn)[16-17]，選擇對照品。以甲醇為溶劑，分別制備1.0 mg/mL的蘆丁、槲皮素、山奈酚、木犀草素、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、牡荊素、異牡荊素對照品液。

供試品液的制備：取漢麻葉粉末5 g，加95%乙醇250 mL(料液比1∶50)，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，水溶解，乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收溶解，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。

TLC分析：分別吸取對照品液、供試品液各5 μL，點(diǎn)于同一個(gè)聚酰胺薄膜上(10 cm×10 cm)，以甲醇-醋酸-水(90∶5∶5)為展開劑，展開，晾干，在紫外燈下(365 nm)觀察。供試品色譜中在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色斑點(diǎn)。

1.3.2 HPLC法分析漢麻葉中黃酮類成分

色譜條件：色譜柱：Venusil XBP-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，USA)；流動(dòng)相①：甲醇∶水∶冰醋酸為50∶50∶0.5；流動(dòng)相②：甲醇∶水∶冰醋酸為46∶54∶0.5；流動(dòng)相③：甲醇∶水∶冰醋酸為65∶35∶0.1，流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

對照品溶液：同“1.3.1”。

供試品溶液：同“1.3.1”。

HPLC分析：分別吸取對照品液、供試品液各10 μL，注入HPLC，每個(gè)樣品重復(fù)3次(n=3)。

1.3.3 漢麻葉抑菌活性分析

參閱文獻(xiàn)[18]，采用瓊脂擴(kuò)散法對漢麻葉進(jìn)行抗菌活性的測定。

供試品溶液：同“1.3.1”。

分別取“1.1”項(xiàng)的4株革蘭氏陰性供試菌和5株革蘭氏陽性供試菌，接種于NA培養(yǎng)基(恒溫37 ℃，傳代培養(yǎng)2～3次)，活化后，接種于NA培養(yǎng)基試管斜面(37 ℃，培養(yǎng)24 h)；另取“1.1”項(xiàng)的1株供試真菌活化2～3次后，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基斜面(恒溫28 ℃，培養(yǎng)3 d)；在各受試菌株試管中分別加入5 mL無菌水，充分振蕩，平板菌落計(jì)數(shù)，將菌懸液濃度稀釋至1×107CFU/mL，按1∶100的比例分別將菌懸液加入50 ℃左右的NA和PDA培養(yǎng)基中，振蕩搖勻，分裝(25 mL/皿，此平板已均勻擺放無菌牛津杯)，冷卻，取出牛津杯，并向兩孔中分別加入供試品液，隨行以甲醇溶劑作為空白對照，以100 μg/mL鏈霉素和制霉素作為陽性對照，將含供試細(xì)菌的平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后測量各平板抑菌圈的直徑；將含有供試真菌的平板放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，3 d后取出測量抑菌圈直徑(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TLC法分析漢麻葉中黃酮類成分結(jié)果

以“1.3.1”中對照品為對照，采用TLC法分析漢麻葉中黃酮成分，結(jié)果見圖1。

圖1 漢麻葉黃酮成分TLC圖Fig.1 The TLC chromatogram of flavonoids from hemp leaves

由圖1可知，采用對照品比較法，針對漢麻葉中可能含有的黃酮成分，以TLC法進(jìn)行初步鑒別，結(jié)果表明，在供試品中，在與蘆丁對照品相應(yīng)的位置上有相應(yīng)的斑點(diǎn)；在與槲皮素對照品相應(yīng)的位置上有相應(yīng)的斑點(diǎn)；在與山奈酚對照品及槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷相應(yīng)的位置上難以判斷是否具有相應(yīng)的斑點(diǎn)；在采用TLC法分析漢麻葉中黃酮成分時(shí)，也曾改變TLC條件對漢麻葉中可能含有的黃酮成分進(jìn)行分析，但可能由于黃酮成分含量較低或分析方法不夠精密等原因，尚需采用HPLC法對漢麻葉樣品中黃酮成分進(jìn)行進(jìn)一步分析。

2.2 HPLC法分析漢麻葉中黃酮類成分結(jié)果

在“2.1”分析基礎(chǔ)上，分別選取“1.3.2”項(xiàng)的流動(dòng)相，采用HPLC法，對漢麻葉中黃酮成分進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。

注：A為漢麻葉供試品；B為槲皮素；C為槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷；D為蘆丁。

注：A為漢麻葉供試品；B為異牡荊素；C為牡荊素。

注：A為漢麻葉供試品；B為木犀草素。

由圖2中a可知，采用“1.3.2”項(xiàng)的流動(dòng)相①分析，漢麻葉供試品色譜圖中，在與蘆丁、槲皮素及槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷對照品相同的保留時(shí)間位置上，均有相同的色譜峰出現(xiàn)，表明漢麻葉中可能含有上述3種黃酮成分。由圖2中b可知，采用“1.3.2”項(xiàng)的流動(dòng)相②分析，漢麻葉供試品色譜圖中，在與異牡荊素、牡荊素對照品相同的保留時(shí)間位置上，均有相同的色譜峰，表明漢麻葉中可能含有上述兩種成分。由圖2中c可知，采用“1.3.2”項(xiàng)的流動(dòng)相③分析，漢麻葉供試品色譜圖中，在與木犀草素對照品相同的保留時(shí)間位置上，均有相同的色譜峰，表明漢麻葉中可能含有該成分。實(shí)驗(yàn)中未檢測到山奈酚的存在；此后，采用對照品加入法對上述結(jié)果進(jìn)行了確認(rèn)。上述結(jié)果說明，在漢麻葉中含有大量的黃酮成分，上述結(jié)果也可為采用HPLC法梯度洗脫的方式建立漢麻葉黃酮成分一測多評的分析體系奠定基礎(chǔ)。

2.3 漢麻葉抑菌活性分析結(jié)果

為了觀察漢麻葉黃酮成分的抑菌活性，在采用“1.3.1”的供試品進(jìn)行抑菌活性時(shí)，也以漢麻葉水提物作對照，結(jié)果見表1。

表1 漢麻葉抑菌活性分析結(jié)果Table 1 The analysis results of antibacterial activities of hemp leaves (n=3)

由表1可知，富含黃酮成分的漢麻葉供試品對10株致病菌均表現(xiàn)出良好的抑菌效果，且呈明顯的量效關(guān)系，尤其對3株食源性致病菌也表現(xiàn)出良好的抑菌效果，結(jié)果見圖3～圖5。雖然漢麻葉水提物也有一定的抑菌活性，但其抑菌效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上漢麻葉醇提物，從而說明漢麻葉抑菌活性成分主要集中于漢麻葉醇提物中，而漢麻葉醇提物中富含大量黃酮成分，關(guān)于漢麻葉抑菌活性成分是否為其所含黃酮成分所致，尚需將漢麻葉黃酮成分分離出來后進(jìn)行深入研究。

圖3 漢麻葉對單增李斯特菌株的抑制作用結(jié)果Fig.3 The results of inhibition effect of hemp leaves on Listeria monocytogenes

圖4 漢麻葉對大腸桿菌的抑制作用結(jié)果Fig.4 The results of inhibition effect of hemp leaves on Escherichia coli

圖5 漢麻葉對金黃色葡萄球菌的抑制作用結(jié)果Fig.5 The results of inhibition effect of hemp leaves on Staphylococcus aureus

由圖3～圖5可知，漢麻葉提取物對3種食源性致病菌具有較好的抑菌作用，可以應(yīng)用于食品及調(diào)味品中，后續(xù)研究將對漢麻葉黃酮成分進(jìn)行系統(tǒng)分離后，進(jìn)行食品、調(diào)味品的研制，并進(jìn)行相應(yīng)的抑菌活性分析。

3 結(jié)論

對漢麻葉黃酮成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在漢麻葉中含有大量的黃酮類成分；同時(shí)，對含有黃酮成分的漢麻葉樣品進(jìn)行抑菌活性分析，結(jié)果表明，漢麻葉具有較好的抑菌活性，尤其對3種食源性致病菌：單增李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌作用良好。關(guān)于漢麻葉抑菌活性成分是否與其所含黃酮成分相關(guān)，還需進(jìn)一步系統(tǒng)研究。鑒于漢麻葉具有淡淡的芳香苦味、良好的抑菌效果及所富含的大量黃酮類成分，上述結(jié)果對于開發(fā)漢麻葉功能性調(diào)味品奠定了基礎(chǔ)。