香葉提取物抗氧化及抗疲勞研究

王少娟，王志英

(1.河南水利與環境職業學院，鄭州 450008；2.黃河科技學院，鄭州 450063)

1 概述

香葉是天竺葵的莖和葉，在我國被廣泛栽培，具有特殊的芳香氣味，其主要成分包括香葉醇、香茅醇和芳樟醇等[1-2]。香葉作為調味劑在日常生活中被廣泛運用，也被醫療行業用于祛風、祛濕和止痛[3]。香葉中除了含有芳香揮發油之外，還含有豐富的黃酮和多糖類成分，而黃酮具有抗氧化、抗疲勞、消炎、降血壓和提高機體免疫力等多種生物學功能。

近年來也發現香葉精油提取物對動物腫瘤細胞具有明顯的療效。通過對體外癌細胞抑制生長的實驗，發現香葉提取物具有明顯的抑制癌細胞生長的效果，擁有作為抗癌新藥開發的潛力。2015年，段宙位等[4]報道香葉油對宮頸癌具有較好的療效；2016年，潘軍輝等[5]也指出香葉油對宮頸癌有較好的療效。此外，香葉在抑制細菌和真菌生長方面也具有很好的療效，對致病性和非致病性細菌具有廣譜殺菌和抑菌作用[6-7]。

2 實驗材料和方法

2.1 實驗材料

香葉干浸膏、維生素C、DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基、超氧陰離子、鄰苯三酚、鹽酸、磷酸、蒸餾水、過氧化氫、硫酸鐵、水楊酸乙醇、亞硫酸鉀、蘆丁、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇、纖維素酶。

2.2 實驗儀器

分光光度計、恒溫水浴鍋、分析天平、真空泵、烘箱、離心機、紫外分光光度計。

2.3 實驗方法

2.3.1 DPPH自由基清除實驗

稱取適量的香葉干浸膏，用濃度為50%的無水乙醇制備濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL 5種質量分數的溶液，將5種質量分數的溶液分別取2 mL加入到5個比色管中，再加入0.2 mmol/L的DPPH·溶液2 mL，搖勻，放置0.5 h，在517 nm處測定吸光度值為A樣品。在5個比色管中加入上述5種濃度的香葉，然后加入無水乙醇2 mL，搖勻，放置0.5 h，在517 nm處測定吸光度值為A對照。其他條件不變，將香葉溶液變為蒸餾水，測定的吸光度值為A空白。稱取適量的維生素，按照上述方法，獲得維生素C的吸光度值。通過下式計算香葉樣品溶液和維生素C的DPPH·清除率[8-9]。

DPPH·清除率(%)=[(A空白-A樣品+A對照)/A空白]×100。

2.3.2 ABTS自由基清除實驗

將ABTS制成7 mol/L的溶液，亞硫酸鉀制成4.8 mol/L的溶液，二者進行等體積的混合，將溶液放置于室內避光12 h，制成實驗所用的ABTS自由基溶液[10-11]。將ABTS自由基溶液制成吸光度值為0.600±0.01的工作液加入6支不同的比色管中，在2組6支ABTS自由基溶液中分別添加濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL 5種質量分數的香葉提取物和維生素C溶液，搖勻，在室溫條件下放置6 min，在波長為734 nm的條件下測定吸光度值，通過下式計算ABTS自由基的清除率[12]。

ABTS自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

式中：A1為加入不同濃度的香葉提取物的吸光度值，A2為等體積的蒸餾水代替ABTS自由基的吸光度值，A0為等體積的樣品蒸餾水代替樣品的吸光度值。

2.3.3 羥自由基清除實驗

配制濃度為9 mol/L的硫酸鐵和水楊酸乙醇溶液和8.8 mol/L的過氧化氫。準備濃度為5，10，15，20 mg/mL的香葉提取物和醋酸[13]。按照硫酸鐵、水楊酸乙醇溶液和過氧化氫溶液的順序分別添加1 mL溶液，在室溫條件下放置1 h，在510 nm處測定吸光度。對羥自由基的清除率見下式。

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

式中：A1為加入不同濃度的香葉提取物的吸光度值，A2為等體積的蒸餾水代替過氧化氫的吸光度值，A0為等體積的樣品蒸餾水代替樣品的吸光度值。

2.3.4 超氧陰離子清除實驗

取濃度為0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液3.5 mL，添加1 mL蒸餾水，最后加入0.5 mL濃度為10 mol/L的鄰苯三酚溶液，搖勻，1 min后在波長為325 nm處測定吸光度A1，之后隔1 min記錄一次A2數據一直記錄到5 min，陰離子清除率穩定，使用濃度為10 mol/L的鹽酸作為鄰苯三酚溶液的空白對照來計算鄰苯三酚的自氧化速率(S1)[14-16]。分別使用濃度為5，10，15，20 mg/mL的香葉提取物和醋酸溶液，按照上面的操作方法，測定實驗后的溶液吸光度，同時計算加樣后的鄰苯三酚自氧化速率[17-18]。

S0=(A2-A1)/3,

超氧陰離子清除率(%)=[(S0-S1)/S0]×100。

式中：S0為鄰苯三酚自氧化速率，A2為第5 min時的吸光度值，A1為第1 min時的吸光度值，S1為加入香葉提取物后的自氧化速率。

3 香葉提取物抗氧化活性研究

3.1 DPPH自由基清除率

圖1 維生素C和香葉提取物對DPPH·的清除率Fig.1 The scavenging rate of vitamin C and Geranium extract on DPPH·free radicals

由圖1可知，隨著維生素C和香葉提取物溶液質量的增加，DPPH·的清除率均逐漸升高，維生素C和香葉提取物對DPPH·的清除率均與二者的溶液質量濃度呈現正相關。當溶液質量濃度低于0.5 mg/mL時，維生素C的DPPH·清除率均高于香葉提取物的DPPH·清除率；當溶液濃度大于0.5 mg/mL時，香葉提取物與維生素C的清除率相接近。香葉提取物對DPPH·的清除率與質量濃度的回歸方程為Y=3.0245+269.2346X，R2=0.8902，香葉提取物的清除率IC50值為(1.12±0.02) mg/mL；維生素C的質量濃度對DPPH·清除率的線性回歸方程為Y=22.2334+187.2365X，R2=0.9961，其IC50值為0.1501 mg/mL。

3.2 ABTS自由基清除率

圖2 維生素C和香葉提取物對ABTS自由基的清除率Fig.2 The scavenging rate of vitamin C and Geranium extract on ABTS free radicals

ABTS自由基能夠很好地溶解于水中，經常被用于測定一些天然產物的抗氧化活性，主要是測定抗氧化劑保持氧化還原的能力。通過使用不同濃度的香葉提取物和維生素C，利用ABTS自由基清除能力的大小來測定香葉提取物和維生素C的抗氧化活性。由圖2可知，香葉提取物濃度低于20 mg/mL時，維生素C的抗氧化活性高于香葉提取物的抗氧化活性，當香葉提取物濃度高于20 mg/mL時，維生素C與香葉提取物的ABTS清除率接近100%。

3.3 羥自由基清除率

圖3 香葉提取物和醋酸對羥自由基的清除率Fig.3 The scavenging rate of Geranium extract and acetic acid on hydroxyl free radicals

羥自由基是目前在生物機體中已知的一種對生物體毒性最強的氧自由基，在生物體內，能氧化生物體中的多種分子，引起機體細胞衰老和死亡，氨基酸、蛋白質、脂質和核酸等多種物質發生氧化損傷，從而引發機體功能紊亂。由圖3可知，香葉提取物對羥自由基的清除能力一直高于醋酸對羥自由基的清除能力。香葉提取物與醋酸對羥自由基的清除能力隨著二者濃度的增高而提高。

3.4 超氧陰離子清除率

圖4 香葉提取物和醋酸對超氧陰離子的清除率Fig.4 The scavenging rate of Geranium extract and acetic acid on superoxide anions

超氧陰離子是人機體內一種特殊的自由基，人機體內存在的數量少，在不接觸羥基時，對機體不能產生損傷，但是與機體接觸后的產物對機體細胞具有較強的氧化毒害作用，除此之外，超氧陰離子還與人類多種疾病發生有關。所以，超氧陰離子的測定也是香葉提取物抗氧化活性測定的重要指標。由圖4可知，香葉提取物與醋酸溶液二者對超氧陰離子均存在一定的清除率，且在相同濃度下，香葉提取物對超氧陰離子的清除率高于醋酸溶液的清除率。

4 香葉提取物抗疲勞作用研究

運動耐力下降是疲勞的最直接體現，小鼠負重游泳時間是反映運動耐力的重要指標，通過對不同濃度的香葉提取物和空白對照小鼠負重游泳時間影響的研究，發現不同濃度的香葉提取物都能提高小鼠負重游泳時間，與空白對照相比較，10 mg/mL的香葉提取物小鼠負重游泳時間提高了47.5%；20 mg/mL提高了69.3%；30 mg/mL提高了118.7%。研究結果顯示，高濃度的香葉提取物能夠提高小鼠的運動耐力。

小鼠長期的激烈運動，肌肉在缺氧的狀態下，發生糖酵解反應，產生大量的乳酸，肌肉的乳酸堆積是疲勞產生的主要原因，激烈運動之后BLA被清除的速度越快，則抗疲勞效果越好。不同劑量的香葉提取物濃度對運動后的小鼠的BLA都有一定的抑制作用。游泳前在安靜的狀態下，香葉提取物對BLA含量無明顯影響。與空白對照組比較，30 mg/mL香葉提取物飼喂的小鼠BLA含量在運動后的0 min和20 min分別降低了7.8%和6.8%。

5 結論

通過研究發現，香葉提取物具有很好的抗氧化和抗疲勞作用；抗氧化作用是通過清除機體的DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基和超氧陰離子而實現抗氧化的功能。無論是機體的自由基還是超氧陰離子，清除率均與香葉提取物濃度呈現正相關，該研究結果與前人的研究結果相似[19-21]。當香葉提取物濃度低于0.5 mg/mL時，香葉提取物對DPPH自由基的清除率低于維生素C的清除率；當香葉提取物濃度高于0.5 mg/mL時，香葉提取物對DPPH自由基的清除率比維生素C對DPPH自由基的清除率高。當香葉提取物濃度低于20 mg/mL時，維生素C的抗氧化活性高于香葉提取物的抗氧化活性；當香葉提取物濃度高于20 mg/mL時，維生素C與香葉提取物的ABTS自由基清除率接近100%。香葉提取物對羥自由基的清除能力一直高于醋酸對羥自由基的清除能力，香葉提取物與醋酸對羥自由基的清除能力一直隨著二者濃度的增高而提高。香葉提取物與醋酸溶液二者對超氧陰離子均存在一定的清除率，隨著香葉提取物和醋酸溶液濃度的提升，二者對超氧陰離子的清除均呈現上升趨勢，且在相同濃度下，香葉提取物對超氧陰離子的清除率高于醋酸溶液的清除率。相比較維生素C和醋酸，香葉提取物擁有較好的抗氧化活性[22-23]。

近年來，抗疲勞和抗氧化活性研究的食品越來越多，例如辣椒素、陳醋、花椒、百里香和生姜等[24-28]，同時香葉的抗氧化活性研究也成為研究重點。香葉提取物的抗疲勞作用是通過對機體多糖成分中自由基的清除來實現的。當運動強度提高，活動量增大時，由于自由基作用而引起的脂質過氧化反應，導致生物體細胞器受到損傷，引起細胞代謝的混亂和病理變化，肌肉不能實現正常的功能，從而產生疲勞[29-30]。除此之外，運動強度增強時，肌肉中的ATP含量會下降，經過10 s左右，機體中的葡萄糖能夠通過無氧酵解提供給機體能量。當機體中血糖濃度低時，血糖能量供應不足，產生疲勞。在實驗中發現，含有多糖和黃酮類成分的香葉能增強機體肝糖原的儲備，從而產生抗疲勞的效果。