云南省核桃果實病害調查及真菌病原形態鑒定

張知曉 季梅 戶連榮 劉凌

摘要：在云南省10個核桃主產區開展了核桃果實病害調查，對所采集的病果標本進行了切片觀察及鑒定。結果表明，在云南省幾個核桃主產區中，大理市和楚雄市病害發生較普遍;核桃果實病害以炭疽病、果腐病、枯果病和黑斑病為主;果實病原菌隸屬于17屬17種，其中，盤長孢狀刺盤孢、殼梭孢屬之一種、葡萄座腔菌、廣布擬盤多毛孢4種真菌出現率最高。

關鍵詞：核桃;果實;病害調查;病原鑒定;云南省

中圖分類號：S436.64

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020） 20-0091-05

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.020

核桃（Juglans regia）學名胡桃，是多年生落葉喬木，核桃仁是高檔堅果，其種殼能開發成工藝品，木材是制作高檔家具的原料，其葉子及果皮可以人藥。因其良好經濟社會價值，云南省將胡桃作為發展八大產業的重要物種，是打造云南省綠色食品的重要組成部分[1]。近些年來，核桃的種植面積快速增加，有數據顯示，截至2017年，云南省核桃種植面積達286.67萬hm2，核桃（干果）總產量為115萬t，產值318億元，居全國第一[2]。據報道，中國為害核桃的病害種類多達30余種。在云南省，核桃黑斑病、炭疽病、枝枯病及根腐病等發生普遍，已成為制約全省核桃產業發展和高產穩產的重要瓶頸[3]。

核桃果實病害是影響核桃產量與質量的直接因素，迄今為止，國內對核桃果實病害的研究主要集中在炭疽病和黑斑病等病害的病原鑒定及防治方面[4.5]。而云南省關于核桃果實病害種類、發生狀況、分布、危害等全面系統的研究未見報道。鑒于植物病害的癥狀相似性很高，在一類病害發生時，不是僅出現由單一病原菌引起的單一病害，而是出現由多種病原菌引起的相同或不同病害癥狀[6]。因此，有必要明確核桃果實病害的發生種類、病原菌及其特點，這是開展病害綜合防控的基礎。本研究針對云南省10個核桃主產區的核桃果實病害進行較全面地野外調查及真菌病原形態鑒定，以期較全面地了解云南省核桃主產區果實病害發生危害現狀及病原菌種類，為云南省核桃病害的防治提供依據，以促進核桃產業的健康發展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

病害標本 于2015年5月至2016年8月，以踏查為主分別在云南省核桃主產區的昆明市、昭通市、曲靖市、楚雄市、大理市、保山市、怒江市、臨滄市、文山市以及麗江市進行病害調查，采集核桃病果標本并記錄病害發生的特點和癥狀。

1.1.2培養基PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、無菌水1L，用于病原真菌培養及對峙培養。

真菌分離培養基：PDA+青霉素50 |g/mL。

細菌分離培養基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaC15 g、瓊脂20 g、無菌水1L，pH 7.2-7.4。

1.2方法

1.2.1 病組織切片及觀察對新鮮病害標本病癥明顯部位進行拍照和描述，制作切片，光學顯微鏡下觀察病原形態;對子實體尚不明顯的病果材料進行保濕，待子實體長出后，再做切片觀察。

1.2.2 病原菌的分離培養采用組織分離法進行果實病原菌的分離。用75%乙醇溶液對供試材料進行表面消毒，在病健交界處切取一定大小的組織，接人加有抗生素的PDA培養基平板上。每皿接人3塊分離材料后將其置于（25±2）℃的恒溫培養箱中培養，在新的PDA平板上進行純化，直至獲得純菌落，4℃保存備用。

1.2.3 病原真菌形態學鑒定

1）病部切片鑒定。于光學顯微鏡下觀察切片上病原菌子實體在植物組織上的著生位置、載孢體、產孢細胞及孢子的形狀、顏色等并進行大小計測。孢子大小的測量一般不少于30個孢子，并查閱相關文獻，進行種類鑒定。

2）純菌種培養物的鑒定。采用培養性狀和微觀形態特征相結合進行鑒定。將分離保藏的純菌株分別轉入PDA平板上，于25℃條件下進行培養，并定期觀察記錄菌落生長狀況（包括菌落形態、顏色、質地及生長和產孢速度等）并拍照。當菌落產孢后，挑取孢子梗、孢子等以無菌水作浮載劑制片，對于腔孢菌類、子囊菌等還需將子實體制作成切片鏡檢，然后在光學顯微鏡下觀察各菌株的產孢結構、產孢細胞的形態特征、產孢方式及孢子形態、顏色等，同時計測載孢體、產孢細胞、孢子等的大小，最后依據所觀測的各菌株宏觀和微觀形態特征，查閱相關文獻確定其歸屬。

2 結果與分析

2.1 病害調查情況

從云南省核桃主產區采集核桃果實病害標本803份，如圖l所示，各地標本采集數量差異較大，標本采集數量的多少在一定程度上可反映核桃不同栽種區果實病害發生的普遍性。采集數量最多的是大理市，達203份，占總采集標本數的25.3%;其次為楚雄市，共采集到185份標本，占總采集標本數的23.0%;標本采集數較少的地區有昆明市（16份）、麗江市（21份）和文山市（4份）。

經調查，云南省核桃果實病害以炭疽病、果腐病、枯果病和黑斑病為主。將所采集的標本進行組織切片和分離純化，分離的培養物鑒定出的病原真菌與病部切片鑒定相吻合，盤長孢狀刺盤孢的出現率最高，為16.33%，其次是殼梭孢屬之一種、葡萄座腔菌、廣布擬盤多毛孢、胡桃盤二孢、核桃黃單胞菌，出現率分別為10.25%、11.47%、10.83%、9.64%和9.84%。出現率較低的菌株為殼二孢屬之一種、成團泛菌2種（表1）。

2.2主要病害的發生危害及病原形態學鑒定

2.2.1 核桃炭疽病

1）癥狀。如圖2A所示，感病果實皮部出現褐色至黑褐色、圓形或近圓形的病斑，中央凹陷，病部有黑色小點產生，有時呈輪狀排列，濕度大時可溢出粉紅色的分生孢子角。發病嚴重的果實病斑擴大連片，病部皺縮，全果可發黑腐爛。

2）病原形態特征。如圖2B至2D所示，核桃炭疽病病原分生孢子盤散生，直徑為122.0-244.0 μm，黑褐色，盤內有較少的暗褐色剛毛。短小的分生孢子梗密生于盤內，無色，產孢方式為內壁芽生瓶體式（ eb-ph），分生孢子圓柱形，長橢圓形，大小為（7.5-17.5）μmx（ 2.5-5.0）μm，單胞，無色。菌落淺褐色，絨狀，邊緣產黑色小點，為病原菌的分生孢子盤，有時可溢出橘黃色的分生孢子角，后期產子囊殼;菌落背面為黑灰色，有黑色斑點;培養基平板不變色。依據形態確定該病原菌為盤長孢狀刺盤孢。

有性態如圖3所示，子囊殼球形、近球形、瓶形，大小為（ 80.0-170.0） μmX （60.0-150.0） μm，常聚生。子囊棒狀，大小為（37.0-50.0） μmx（7.5-10.0）μm，無柄。子囊孢子橢圓形，大小為（12.5-17.5） μmx（4.0-5.0）μm，單胞，無色。依據形態確定該病原菌有性態為圍小叢殼（Glomerella cigulata）。

3）流行病學研究。病原菌以菌絲體、分生孢子盤或子囊殼在病果及病葉上越冬。次年，孢子成熟，并借風雨傳播侵染。果實的炭疽在夏季，降雨量較集中時發病較重。栽植密度過大、樹冠稠密、通風透光不良的核桃園發病較重。葉部也可受害。

4）分布。云南省昆明市、曲靖市、大理市;其有性態見于曲靖市。

2.2.2 核桃枯果病

1）癥狀。如圖4A所示，感病果實形成較大面積的黃褐色病斑，果皮干枯，不規則開裂。

2）病原。如圖4B至圖4E所示，子座埋生于寄主表皮下，大小為（ 214.0-590.0）μmX（ 122.0-203.0）μm，內埋生不規則形、半圓形、球形的分生孢子器，大小為[（ 70.0-）120.0-450.0（ -550.0）]μmx[ （40.0-）80.0-190.0（-300.0）] μm;分生孢子梗圓柱形，少有隔，無色，全壁芽生單生式（ hb-sol）產孢。分生孢子頂生，梭形，大小為[（ 2.5-） 5.0-11.0]μmx（ 2.5-4.0）μm，單胞、無色，有時具油滴。依據形態確定該病原菌為殼梭孢屬之一種。

3）流行病學研究。病原菌以菌絲體和子座在病殘體上越冬。次年春，分生孢子借風雨傳播，侵染。主要為害枝條，葉片、果實也可受害。

4）分布。云南省曲靖市、大理市、保山市、臨滄市。

2.2.3 核桃果腐病 由不同病原菌所引起的果腐都在果實上形成變色的病斑，中部凹陷或不凹陷，大多數果肉已開始腐爛。

1）病原一的癥狀、病原、流行病學研究及分布如下。

①癥狀。如圖5A所示，感病果實果皮出現紫黑色、近黑色病斑，逐漸擴大并凹陷，其上可見密集的黑色小點，為病原菌的子座和分生孢子器;后期果皮皺裂，內部果肉隆起外露，密生黑色小顆粒，為病原菌有性態的子座和假囊殼。

②病原。如圖SB所示，假囊殼聚生，初埋生于子座，后突破子座外露，近球形，有的具喙，假囊殼大小為（100.0-175.0）μmx（ 68.0-150.0） μm。子囊棍棒形，大小為（42.0-57.5）μmx（7.5-12.5）μm，無色;子囊孢子不夠成熟。依據形態確定該病原菌為葡萄座腔菌。

無性態：群生小穴殼的分生孢子器球形、近球形，大小為（ 130.0-230.0）μmX（ 100.0-200.0）μm，多個聚于子座。分生孢子梗短，分生孢子梭形、長橢圓形，大小為[ 17.5-25.0（-30.0）] μmX [6.0-7.5 （-8.5）]μm，單胞、無色。依據形態確定該病原菌無性態為群生小穴殼（圖5C至圖5E）。

③流行病學研究。核桃園內有由該病原菌所致潰瘍病（干腐病），故病原菌既可在病果、病落果上，也可在病枝上越冬。次年春，氣候適宜時，子囊孢子成熟并傳播侵染。分生孢子可作為再侵染源，重復侵染。

④分布。云南省臨滄市;其無性態群生小穴殼分布于云南省楚雄市、保山市。

2）病原二的癥狀、病原、流行病學研究及分布如下。

①癥狀。如圖6A所示，病果出現灰黑色、黑色病斑，且皮部開裂，表生黑色小粒點，為病原菌的分生孢子盤;后期病斑幾乎擴大至全果，呈暗褐色，皺縮凹陷，果腐并干枯，出現黑色小粒點，為病原菌的子囊殼。

②病原。如圖6B至圖6E所示，分生孢子盤初埋生，后突破寄主表皮，直徑為126.0-224.0（ -357.0）μm。分生孢子梭形，大小為[15.0-21.5 （-25.0）]μmx [5.0-5.5（ -7.5）]μm，有4個隔膜（隔膜處略縊縮或不縊縮），使其成為5個細胞。其中，兩端細胞無色，中間3個細胞同色，均為淺褐色，大小為9.0-15.0μm;孢子頂端具3-5根細長的附屬絲，長為5.0-12.5（ -15.0） μm，基部具l根附屬絲。菌落絨狀，白色，較厚，具環紋或無，后期表面可產黑色顆粒狀物，為病原菌的分生孢子盤，可溢出黑色黏液，為病原菌的分生孢子;菌落背面呈淺黃色至淺褐色，具黑色斑點。培養基平板不變色。依據形態確定該病原菌為廣布擬盤多毛孢。

有性態：如圖7A至圖7C所示，子囊殼為瓶形、近球形，大小為（150.0-190.0） μmx（100.0-164.O）μm，淺褐色，具孔口。子囊棒狀，大小為（50.0-68.0）μmx7.5 μm，無色，其間有側絲。子囊孢子橢圓形，有的兩端略尖，直或微彎，大小為[ 10.0-12.5（ -15.0）]μmx[4.0-5.0（-7.5）]μm，具2個隔膜，即3胞，淺褐色，隔膜色較深。依據形態確定該病原菌有性態為胡桃多毛殼孢。

③流行病學研究。病菌以菌絲體、分生孢子盤或子囊殼在病株及病殘體上存活越冬，于次年春，孢子借風雨傳播，從傷口或孔口侵入致病。每年4-9月發病，夏季高溫有利于該病害的發生。

④分布。云南省曲靖市、楚雄市、大理市、臨滄市;其有性型僅見于大理市和臨滄市。

3 小結與討論

本研究表明，云南省核桃果實病原菌多樣性豐富，且各地存在差異。各地核桃病果標本采集數量在一定程度上反映病害發生的普遍性，在云南省幾個核桃主產區中，大理市和楚雄市病害發生較普遍，這與不同地區的氣候條件、核桃品種、樹齡及核桃種植地的立地條件和管護等都有密切關系[7，8]。云南省核桃果實病害以炭疽病、果腐病、枯果病和黑斑病為主。病果共鑒定出病原菌17種，隸屬于17個屬，其中，僅鏈格孢屬、刺盤孢屬[6]、擬盤多毛孢屬[9]、泛菌屬及黃單胞菌屬[10]5個屬曾作為核桃果實病害的病原菌被報道。雖然這些病原菌分離鑒定自果實的發病部位，但要確定它們是核桃果實病害的病原菌，還有待通過科赫法則進行進一步的驗證。

出現率最高的4種病原真菌為盤長孢狀刺盤孢、殼梭孢屬之一種、葡萄座腔菌及廣布擬盤多毛孢，其中，盤長孢狀刺盤孢能夠引起核桃果實炭疽病這一結論與王清海等[11]的研究一致，而其他3種也均作為核桃葉部及枝干病原菌被報道[12，13]，表明在葉片及枝干上引起病害的病原真菌，在核桃果實上同樣可引起病害。此外，隋韻靜[14]還從陜西省核桃果仁水腐病的感病植株分離出一株蒼白桿菌（Ochrobactrum pimitosum]，而該菌種在本次調查中并未發現。

由于果實發病后直接使其失去食用和商品價值，且在貯運過程中病果病原菌會迅速傳播再侵染，導致更多的健康果實受到侵染，造成大量鮮果腐爛。因此，核桃果實病害需引起重視。有效降低病害發生與危害是一切研究的目標，而病害的準確識別和明確其生物學特性是建立植物病害防治措施的前提和基礎。因此，核桃果實病害的識別和分離培養具有重要意義。為有效降低病害的發生，可采取以下措施：第一，因地制宜，選用適應當地條件的核桃抗病品種，合理施肥;第二，加強果園管理，清除病果、病枝和病葉，并集中燒毀或深埋。科學修剪，改善通風透光條件;第三，除了物理防治、農業防治措施外，也可在病害發生的不同時期科學施用安全、高效的化學藥劑進行防治。

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作者簡介：張知曉（1988-），女，云南個舊人，助理研究員，碩士，主要從事森林保護研究，（電話）13529349411（電子信箱）36062613@qq.com;

通信作者，劉凌（1981-），女，云南曲靖人，副研究員，博士，主要從事森林保護研究，（電子信箱）liuling_km@ 126.com。