SSllla基因在云南高抗性淀粉特種稻的遺傳變異

李霞 杜娟 楊曉夢 普曉英 楊加珍 曾亞文

摘要：對云南省高抗性淀粉特種稻品系及功米系列品種進行SSHla基因已報道剪接位點SNP檢測，結果顯示，云南省高抗性淀粉材料未出現(xiàn)已報道的剪接位點SNP突變。進一步對云南高抗性淀粉特種稻SSllla基因的序列進行遺傳變異分析，共發(fā)現(xiàn)SNP遺傳變異位點59個，插入缺失變異位點6個。其中，分布于基因編碼區(qū)域的SNP位點18個，非同義變異12個。分析這些非同義變異位點在6份高抗性淀粉特種稻材料與云南省地方對照品種的差異，結果顯示6份高抗性淀粉特種稻材料與對照品種的差異，主要為秈粳稻之間的差異，只有功米2號存在SNP特異性變異。

關鍵詞：SSIlla基因;抗性淀粉;水稻;遺傳變異

中圖分類號：S511

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020） 20-0035-04

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.008

隨著飲食習慣和生活方式的改變，Ⅱ一型糖尿病的發(fā)病人數(shù)逐年增加[1]。研究表明，合理增加抗性淀粉的攝取量，可有效控制體重，具有潛在預防慢性病的功效[2，3]。水稻是全球1/3以上人口的主食，水稻品種間血糖指數(shù)GI值變幅為48-93，是開發(fā)預防糖尿病及降低餐后血糖主食的重要來源[4，5]。目前，國內已培育出一些高抗性淀粉含量水稻品種，如云南省農(nóng)業(yè)科學院的功米3號[6]，上海市農(nóng)業(yè)科學院的降糖稻1號[7]，浙江大學培育的突變體RSlll[8]。雖然高抗性淀粉水稻已有一定規(guī)模的應用，但對其遺傳機制的研究卻較少。有研究表明，SSIlla基因剪接位點的SNP突變可以導致水稻子粒抗性淀粉含量的升高[9]。同時，SSllla基因在不同水稻材料基因組中較其他淀粉合成相關基因表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，是淀粉合成酶類中最多樣化的基因[10]。因此，本研究對云南省高抗性淀粉特種稻品種功米系列及2份高抗性淀粉品系進行SSllla基因的同源克隆，并對其基因序列進行比較分析，以期通過上述檢測，明確SSllla基因在云南省高抗性淀粉特種稻的遺傳變異，為下一步云南省高抗性淀粉特種稻的育種工作提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術與種質資源研究所功能食品作物團隊選育高抗性淀粉水稻功米系列品種及品系，共計6份（抗性淀粉含量>3%），分別為功米2號、功米3號、功米4號、功米5號、17SM36、17SM37，對照為云南粳稻品種合系35、秈稻品種滇屯502，二者為抗性淀粉含量偏低材料。

1.2方法

1.2.1 DNA提取選取各材料的幼嫩葉片，利用天根生化科技（北京）有限公司植物基因組提取試劑盒（DP320）提取試驗材料的基因組DNA，具體操作參照試劑盒說明書進行。提取后的DNA樣品置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計及PCR擴增 利用參考基因組SSllla基因序列設計特異引物（表1）。以8份材料的基因組DNA為模板，高保真酶I-5TM 2x High-FidelityMaster Mix（TPOOI，北京擎科生物技術有限公司）進行PCR擴增。擴增程序為98℃預變性2 min;98℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán);72℃延伸10 min，25℃保存。在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳產(chǎn)物檢測，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.3 目的片段回收及克隆利用DNA凝膠回收試劑盒（CE0101-50型）對目的片段進行回收，將回收片段連接到pClone007載體上（007VS型），轉化感受態(tài)TreliefrM 5a Chemically Competent Cell（ TSC01型），進行陽性克隆篩選并進行PCR鑒定。以上試劑均購于北京擎科生物技術有限公司，試驗操作均按照上述試劑盒說明書進行。

1.2.4

SSllla序列分析對鑒定的陽性克隆送樣測序，每個樣品送3個陽性克隆，測序由北京擎科生物技術有限公司實施。序列分析利用DNAstar軟件完成。Blast分析通過NCBI（ http：//www. ncbi.nlm. nih.gov/）在線進行。

2 結果與分析

2.1 已報道SSHla基因剪接位點SNP突變檢測

利用已報道的CAPS標記，對云南省高抗性淀粉特種稻進行SSllla基因第六外顯子剪接位點SNP突變檢測。通過MluCl內切酶對合系35、功米2號、功米3號、功米4號、功米5號、17SM36、17SM37、滇屯502進行酶切反應檢測。結果如圖1所示，6份高抗性淀粉特種稻材料不能被MluCl內切酶切開，說明這6份材料并未發(fā)生相應的SNP變異，也未產(chǎn)生新的MluCl酶切位點。

2.2 SSIHa基因在高抗性淀粉特種稻的遺傳變異

結合參考基因組序列信息，通過對6份云南省高抗性淀粉特種稻材料及對照品種的SSllla基因序列的遺傳變異分析，共計發(fā)現(xiàn)了66個變異位點，其中SNP變異位點59個，41個位于內含子及基因上游區(qū)域，18個SNP突變位點位于外顯子區(qū)域（表2）。同時，位于外顯子區(qū)域的SNP位點中有同義突變6個，非同義突變12個。除了上述的SNP的變異外，還發(fā)現(xiàn)了6個插入/缺失突變，1個在基因上游序列出現(xiàn)，其他均位于內含子區(qū)域（表2）。

2.3 SSHla基因在高抗性淀粉特種稻與對照品種的差異分析

通過對6份云南省高抗性淀粉特種稻材料及對照品種的SSllla基因全長序列與參考基因組序列的遺傳變異分析，共計發(fā)現(xiàn)12個非同義突變位于外顯子區(qū)域。由于編碼區(qū)的非同義突變可能會引起蛋白質功能的改變，因此重點分析了上述12個SNP變異位點在2個對照品種與高抗性淀粉特種稻之間的差異。結果（表3）顯示，功米3號及17SM36與對照秈稻品種滇屯502基因型在這12個SNP位點上表現(xiàn)出了完全相同的基因型。功米4號、功米5號及17SM37基因型與粳稻品種合系35在這12個位點表現(xiàn)出很高的相似性，只在5353483、5353812、5355663、5357570這4個位點上與滇屯502有一致的基因型，推測這些差異可能來源于秈粳雜交的結果。功米2號在5353162、5353784、5353826位點上表現(xiàn)出與2個對照品種不同的基因型差異。同時，6份高抗性淀粉特種稻材料在5353319、5353685、5354337、5354415這4個位點表現(xiàn)出了秈粳稻之間的差異。

3 討論

隨著中國大健康產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展及人民生活水平的提高，人們的營養(yǎng)保健意識不斷增強。抗性淀粉作為安全健康的新型功能性食品，越來越受到消費者的青睞。水稻作為中國人口的主糧，開展高抗性稻米的基礎研究和種質資源的選育意義重大[11]。目前，已克隆的水稻子粒中影響抗性淀粉含量的基因包括SSllla和SEB[9，12]，二者都屬于淀粉合成酶基因。本研究對云南省抗性淀粉含量較高的功能稻米品種及品系SSfffa基因的序列分析顯示，功米3號、功米4號、功米5號及17SM36品系與對照品種SSllla基因序列基本一致，編碼區(qū)域的12個非同義突變也只在秈粳稻之間存在差異，基本確定上述5份高抗性淀粉材料的抗性淀粉升高與SSllla基因的變異無關。功米2號在5353162、5353784、5353826位點上表現(xiàn)出與其他7份材料不同的基因型差異。由于其他5份高抗性淀粉材料的基因型完全一致，并且以上3個位點與2個對照表現(xiàn)出相同的基因型，因此推測這些位點可能并不影響抗性淀粉的含量。此外，由于功米2號是其中惟一的有色米材料，以上3個差異也可能與其特殊的種皮顏色有關。基于以上結果推測，云南省高抗性淀粉特種稻抗性淀粉含量的升高，可能與SSllla基因的遺傳變異沒有直接的相關性。研究表明，作物抗性淀粉含量與直鏈淀粉的比例呈正相關[13.14]，而GBSSI編碼的Wx蛋白質對水稻直鏈淀粉含量有積極影響[15]。由此說明，除了淀粉合成基因SSllla和SEB對抗性淀粉含量有影響外，其他淀粉合成基因也可能影響抗性淀粉含量。目前，參與淀粉合成的酶類主要有6大類，分為可溶性淀粉合成酶（Soluble starch syn-thase）、淀粉分支酶（Starch branching enzyme）、淀粉脫支酶（ Debranching enzyme）、顆粒結合淀粉合酶（ Granulebound starch synthase）、ADP葡萄糖焦磷酸化酶（ AGPase）和質體淀粉磷酸化酶（Pho）[16.17]。已有報道顯示，淀粉合成相關酶類的遺傳變異對水稻淀粉的物理特性有不同程度的影響[18]，因此，后續(xù)試驗將對云南省高抗性淀粉特種稻在其他淀粉酶合成基因的遺傳變異進行深入分析，探究其與云南省高抗性淀粉特種稻之間的關系，以期為云南省高抗性淀粉特種稻形成的遺傳基礎研究提供線索。

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作者簡介：李霞（1981-），女，河南獲嘉人，助理研究員，博士，主要從事功能作物分子育種研究，（電話）15398480628（電子信箱）lixia_napus@163.com;通信作者，曾亞文，男，二級研究員，博士，主要從事功能作物育種研究，（電子信箱）zengyw1967@ 126.com，