豬DKK2基因的多態性與母豬產仔數性狀的關聯分析

周佳偉 喬木 吳俊靜 王孝忠 劉貴生 梅書棋 彭先文

摘要：母豬的繁殖性狀是豬重要經濟性狀之一，但由于其遺傳力低，導致母豬繁殖性狀常規選擇進展緩慢。通過SANGER測序的方法檢測DKK2基因內SNP位點，并與產仔數性狀進行關聯分析。結果表明，在DKK2基因第二內含子存在一個新SNP位點，根據SNP命名方法將其命名為8：g.114967878A>G.且該SNP位點與產活仔數性狀顯著相關。豬DKK2基因的新SNP位點8：g.114967878A>G對豬的產活仔數性狀存在潛在的調控作用。

關鍵詞：豬;DKK2;SNP;產仔數

中圖分類號：S828;Q343.1+5

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114[ 2020） 20-0138-03

DOl：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.031

母豬生產力直接影響豬場經濟效益，產仔數性狀是衡量母豬生產力的一個主要指標。然而總產仔數和產活仔數的遺傳力只有0.09，屬于低遺傳力性狀[1]，導致母豬繁殖性狀常規選擇進展緩慢。隨著分子生物學技術的迅速發展，常規育種與標記輔助選擇（MAS）相結合的方法有效地加快了豬產仔數性狀的選擇進展。通過候選基因法和基因組掃描的方法篩選出多個與產仔數性狀相關的分子標記，如雌激素受體（Estrogen receptor，ESR）、卵泡刺激素p亞基（Follicle stimulating hormone p subunit， FSH[3）和視黃醇結合蛋白4（ Retinol binding protein 4，RBP4）基因等[2-4]，但仍然有很多與產仔數相關的SNP位點有待挖掘。

DKK（Dickkopf）蛋白家族是WNT信號通路的負調控因子，主要成員有DKK1、DKK2、DKK3和DKK4。DKK2和DKK4蛋白可結合LRP5/6，抑制WNT信號[5]。研究發現DKK2在上皮性卵巢癌細胞中顯著下調，且在上皮性卵巢癌細胞中DKK2具有更高甲基化水平，超表達DKK2顯著抑制卵巢癌細胞的生長和遷移[6]。DKK2在出生后2ld內的小鼠卵巢中表達，但在完全生長卵母細胞、排出卵母細胞以及發育早期胚胎中不表達，說明了DKK2是由顆粒細胞合成，且在卵母細胞與顆粒細胞對話中起著重要作用[7]。

研究表明，利用Affyetrix公司豬基因組芯片檢測大白豬和二花臉豬排卵前卵泡中差異表達的基因[8]，發現DKK2基因呈現差異表達，通過性狀關聯分析發現DKK2基因啟動子區的c.-1130 T>C與中國瘦肉豬新品系產仔數顯著相關;通過雙熒光、EM-SA、ChIP驗證DKK2 c.-1130 T>C位點影響C/EBP[3與DKK2啟動子的結合能力，位點為T時，DKK2基因啟動子活性極顯著增強，抑制WNT通路基因表達[9]。本研究以DKK2基因為研究對象，探究DKK2基因內與產仔數相關的SNP位點，為母豬產仔數的遺傳改良提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

采集湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所和湖北天之力優質豬育種有限公司聯合培育的黑豬新品系417頭母豬的耳組織樣品，且所有個體均記錄了總產仔數和產活仔數。使用標準苯酚氯仿萃取法提取基因組DNA，保存于-20℃。

1.2 PCR擴增

根據豬DKK2基因的基因組序列（GenBank：NC_010450.4）設計引物，引物序列見表1。50 μLPCR反應體系為：100 ng模板DNA、lOxBuffer（含Mg2+）5 μL、上下游引物各0.5 μmol/L、2.5 μmol/LdNTPs、1 UTaq DNA聚合酶，ddH2O補足至50 μL。PCR反應程序為：94℃預變性3 min;94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45 s，35個循環;72℃延伸10 min;4℃保存。PCR擴增產物用生工生物工程（上海）股份有限公司的Gel Extraction Kit試劑盒進行純化;將回收后的PCR產物交由北京奧科鼎盛生物科技有限公司i井行SANGER測序。

1.3 群體關聯分析

采用SAS 9.1軟件中一般線性模型將417頭黑豬新品系DKK2基因8：g.114967878A>C位點的基因型與產仔數性狀進行關聯分析。同時采用REC程序計算基因加性效應和顯性效應，并進行顯著性檢驗，所采用模型為Yij=+ Gi+Fj+ei，其中，Yij為性狀表型值，μ為平均值，G為基因型效應（包括基因加性效應和顯性效應;加性效應用1、0和一1分別代表AA、AC和CC基因型，顯性效應用1、一1和1分別代表AA、AG和CC基因型）;Fj為豬場綜合效應;eij為殘差效應。

2 結果與分析

2.1 DKK2基因8：g.114967878A>G位點在黑豬新品系中的等位基因頻率

通過SANCER測序檢測417頭黑豬新品系DNA樣品中DKK2基因的SNP位點，在DKK2基因第二內含子區域發現了一個新的A>C突變的SNP位點（圖1），將其命名為8：g.114967878A>G，并計算該位點的基因型頻率和等位基因頻率。結果（表2）表明，在黑豬新品系中DKK2基因8：g.114967878A>C位點表現為AA、AG或GG 3種基因型，A等位基因頻率為0.9，是優勢等位基因，通過卡方檢驗發現8：g.114967878A>G位點在黑豬新品系中均符合哈代溫伯格平衡（P>0.05）。2.2 DKK2基因8：g.114967878A>G位點與產仔數性狀的關聯分析

417頭黑豬新品系DKK2基因8：g.114967878A>C位點的基因型與產仔數性狀進行關聯分析。結果（表3）表明，黑豬新品系中8：g.114967878A>C位點的GG基因型的產活仔數顯著少于AA基因型和AG基因型（P<0.05），且顯性效應達到顯著水平（P<0.05），但該SNP位點在黑豬新品系中與總產仔數相關性不顯著。

3 討論

母豬生產力直接影響豬場經濟效益，產仔數性狀是衡量母豬生產力的一個主要指標。豬DKK2基因是通過基因芯片及EST策略鑒定的新基因，且在大白豬和二花臉豬排卵前卵泡中差異表達[8]。豬DKK2基因定位在8號染色體長臂末端SSC8： 123，274， 617-123， 279， 223（ Ensembl Sscrofa10.2）.通過pig QTL database查詢，在DKK2基因附近（SSC8的107.5 cM）存在排卵數性狀的QTL，加性效應為3.07[10，11]。因此，DKK2可能為該排卵率QTL的位置候選基因。性狀關聯分析發現DKK2基因啟動子區的c.-1130 T>C與中國瘦肉豬新品系產仔數顯著相關;且該SNP位點通過影響DKK2基因的轉錄，從而調控卵泡發育。

本研究通過SANCER測序方法鑒定出DKK2基因第二內含子內的一個新SNP位點，并將其與產仔數性狀關聯分析發現該SNP位點的CC基因型的產活仔數顯著少于AA基因型和AG基因型（P<0.05），且顯性效應達到顯著水平（P<0.05），為母豬產仔數性狀的遺傳改良提供了新靶點。

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作者簡介：周佳偉（1989-），男，江西瑞昌人，助理研究員，博士，主要從事豬遺傳育種研究，（電話）18674037082（電子信箱）422374839@qq.com;

通信作者，彭先文（1974-），男，研究員，主要從事豬遺傳育種研究，（電子信箱）pXWPal@163.com。