膠體金法快速檢測蔬菜中多菌靈·吡蟲啉和啶蟲脒的應用研究

陳美蓮　章慧　豐東升　張維誼　韓奕奕　王敏　周雨璊　馬穎清　汪弘康　王藝嬌

摘要 [目的]研究膠體金法在蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒殘留量檢測的應用，并將該方法與液相色譜-串聯質譜法比較，證實膠體金試紙條在檢測蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒殘留的適用性。[方法]試驗驗證了膠體金法檢測蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒在不同基質中的靈敏度，并將該方法與液相色譜-串聯質譜法比較驗證其假陰性和假陽性率。[結果]膠體金法檢測蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的檢出限分別為0.5、0.5和0.2? mg/kg;該方法在不同基質中的穩定性較好;實驗室加標驗證3種農藥殘留檢測的假陰性率和假陽性率均為0，與參比方法無顯著性差異（χ2<3.84）;實物陽性樣品驗證3種農藥殘留檢測的假陰性率均為0，假陽性率分別為0、0和6.67%，但與參比方法均無顯著性差異（χ2<3.84）。除多菌靈與阿苯達唑有100%交叉反應外，多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒與該研究中試驗的常見農藥均無交叉反應。[結論]膠體金法快速檢測蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒操作簡便、快速、準確、穩定，可作為部分蔬菜上市前殘留檢測的一種有效手段。

關鍵詞 膠體金法;蔬菜;多菌靈;吡蟲啉;啶蟲脒;殘留量

中圖分類號 TS207.5+3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）22-0193-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.052

Study on Colloidal Gold Rapid Detecting Carbendazol，Imidacloprid and Acetamiprid in Vegetables

CHEN Mei-lian，ZHANG Hui，FENG Dong-sheng et al （Shanghai Agri-products Quality and Safety Center，The Ministry of Agriculture Food Quality Supervision and Inspection Center（Shanghai），Shanghai 201708）

Abstract [Objective]To study the application of colloidal gold method on detecting carbendazol，imidacloprid and acetamiprid in vegetables and compare to liquid chromatography-tandem mass spectrometry method to make sure the reliability of colloidal gold strip for determination of carbendazol，imidacloprid and acetamiprid residues in vegetables.[Method]The experiment verified the sensitivity of colloidal gold method for detecting carbendazim，imidacloprid and acetamiprid in vegetables in different matrices，and compared the method with liquid chromatography-tandem mass spectrometry to verify its false negative and false positive rates.[Result]The detection limit of colloidal gold rapid detecting carbendazol，imidacloprid and acetamiprid were 0.5 mg/kg，0.5 mg/kg and 0.2? mg/kg，their stabilities in different matrix was good.Laboratory labeling verification result showed that the false negative and positive rate were 0，no significant difference with reference method （χ2<3.84）.Physical positive sample verification result showed that their false negative were 0，their positive rate were 0，0 and 6.67%，no significant difference with reference method（χ2<3.84）.There were no cross-reaction between carbendazol，imidacloprid，acetamiprid and other pesticides except for 100% cross-reaction between carbendazol and albendazole.[Conclusion]Colloidal gold rapid detection of carbendazol，imidacloprid and acetamiprid in vegetables are simple，rapid，accurate and stable.It can be used as an effective method to detect the residues of carbendazol，imidacloprid and acetamiprid in vegetables.

Key words Colloidal gold method;Vegetables;Carbendazol;Imidacloprid;Acetamiprid;Residue

基金項目

上海市科技興農重點攻關項目（2019-02-08-00-15-F01147）。

作者簡介 陳美蓮（1963—），女，上海人，農業推廣研究員，從事農產品質量安全檢測及風險評估工作。

收稿日期 2020-04-02;修回日期 2020-05-11

我國是一個農業大國，農藥使用品種多、用量大，蔬菜中的農藥殘留嚴重影響了我國食用農產品的質量信譽，更損害了消費者的身體健康。目前，專屬性強、靈敏度高的農藥殘留檢測方法均為檢測費用高、周期長、操作復雜的儀器分析方法。為提高監管與檢驗效率，降低監管部門、檢驗部門、種植基地、商家和其他市場流通環節對重點、高風險農藥殘留項目的監測的成本，解決上述監管需求，急需開發具有特異性強、靈敏度高、樣品前處理簡單的農藥殘留快速檢測方法。目前國內最常用的蔬菜中農藥殘留的快速測定方法是酶抑制率法[1]，而該方法受酶特異性影響，檢測的農藥種類有限[2]，多用于有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢測[3]。膠體金免疫層析技術是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等多種方法有機結合在一起的固相標記免疫檢測技術，該技術具有簡單、快速、準確和無污染等優點，自1971 年Faulk W P和Taylor G M 首次建立，便因其眾多優點被廣泛應用于醫學檢測、食品安全及動物疫病診斷等各領

域[4]。在蔬菜農藥殘留檢測中，膠體金免疫層析法可以有效彌補酶抑制率法存在的不足，而且可檢測的藥物種類更多，但目前生產的檢測試紙種類較少，制約了該檢測技術的大面積推廣[5]。

多菌靈為一種高效低毒的廣譜內吸性殺菌劑，生產應用范圍廣泛，對螨蟲有一定的殺滅作用，對果樹、糧食作物和蔬菜等的病害和食用菌栽培生產過程中的病害有一定的防治作用，在水果保鮮、防腐防霉等方面也有一定作用[6]。吡蟲啉是一種廣譜、高效、低毒、內吸性強、殘效期長的殺蟲劑，對糧食作物、油料、蔬菜、水果等多種蟲害有防治效果[7]。啶蟲脒是一種新型廣譜且具有一定殺螨活性的殺蟲劑，廣泛用于水稻、蔬菜、果樹、茶葉的蚜蟲、飛虱等蟲害的防治[8-9]。多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒均為《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2019）[10]在蔬菜產品中有限量規定的農藥品種，其中啶蟲脒還被列為2018年上海市蔬菜重點推薦使用的農藥品種。雖然3種農藥均屬低毒農藥，但其使用廣泛，如果過量使用或使用不當，殘留在蔬菜中會對人體健康帶來隱患，因此其在蔬菜中的殘留水平值得關注。為滿足蔬菜質量安全的監管和農戶生產自檢的需要，筆者對膠體金法快速測定蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的技術開展了應用研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 多菌靈快速檢測試紙條（YRSPN1012）、吡蟲啉快速檢測試紙條（YRSPN1027）和啶蟲脒快速檢測試紙條（YRSPN1026），深圳市易瑞生物技術股份有限公司;多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒標準品，德國Dr.Ehrenstorfer。

1.2 儀器與設備 膠體金法讀數儀YR-100，深圳市易瑞生物技術股份有限公司;液相色譜-質譜聯用儀（LC-MS），沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 膠體金法。

1.3.1.1 原理。該研究采用膠體金免疫層析技術，將金標抗體置入檢測微孔中凍干，在硝酸纖維素膜的檢測線（T 線）

處分別包被多菌靈、吡蟲啉或啶蟲脒抗原，在對照線（C 線）處包被羊抗鼠IgG 二抗。樣本中若含有多菌靈、吡蟲啉或啶蟲脒，在微孔溫育過程中與膠體金標記的多菌靈、吡蟲啉或啶蟲脒單克隆抗體結合，從而抑制了金標抗體與硝酸纖維素膜上包被的多菌靈、吡蟲啉或啶蟲脒抗原的結合。若T 線顏色弱于C 線顏色或不顯色，即樣品中的多菌靈、吡蟲啉或啶蟲脒含量等于或超過產品檢出限，反之則低于產品檢出限。

1.3.1.2 前處理。取（2.0±0.1）g剪碎或攪碎后的樣品加入到15 mL 或50 mL 離心管中;量取并加入8 mL YRSPN 樣品通用提取液，充分振蕩混勻，即為待測液。

1.3.1.3 檢測。從配套的檢測試劑盒里去除紅色微孔試劑，依次加入200 μL待測液，用一次性吸管上下抽吸混勻后反應3 min（20～40 ℃）。取出試紙條，將試紙條插入上述紅色微孔中，反應6 min（20～40 ℃）。從微孔中取出試紙條，輕輕刮去試紙條下端的吸水海綿，并進行結果判讀。若T 線顏色≥C 線顏色，則結果為陰性（未檢出）;若T 線顏色

1.3.2 液相色譜-串聯質譜檢測方法。多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的檢測按照《水果和蔬菜中450種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》（GB/T 20769—2008）[11]規定的方法測定。

1.4 結果評價 試驗結果按照國家食品藥品監督管理總局制定的《食品快速檢測方法評價技術規范》評價膠體金方法的靈敏度、特異性、假陽/陰性率和與參比方法一致性。

2 結果與分析

2.1 不同基質的靈敏度試驗 《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2019）[10]中對多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒在蔬菜中的殘留量均有規定。該試驗針對該標準中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒在各類蔬菜中的限量標準，選定不同蔬菜品種和加標濃度。除GB 2763—2019中明確限量的蔬菜品種外，該試驗另選市面上常見的幾種蔬菜作為驗證樣品開展靈敏度試驗，每種農藥共選定9種蔬菜，具體蔬菜品種詳見表1～3。每種蔬菜均設置4個濃度，即本底濃度（空白）、1/2限量值濃度或產品標識檢出限濃度（如產品檢出限即為該藥物在某種蔬菜上的限量值即設定1/2限量值濃度，如產品檢出限低于該藥物在某種蔬菜上的限量值則設定產品標識檢出限濃度）、限量值濃度和2倍限量值濃度。每份試驗樣品均做3個重復，試驗結果見表1～3。膠體金試劑條說明書中描述多菌靈的檢出限為0.5～1.0 mg/kg，吡蟲啉的檢出限為0.5～1.0 mg/kg，啶蟲脒的檢出限為0.2～0.5 mg/kg。試驗結果顯示在不同蔬菜基質中多菌靈和吡蟲啉的檢出限均能達到0.5 mg/kg，啶蟲脒的檢出限均能達到0.2 mg/kg，3種農藥驗證的檢出限均能達到與膠體金試劑條說明書中描述的最低水平，且能滿足國家殘留限量標準的要求。

2.2 實驗室加標假陽性率試驗 多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的靈敏度試驗中各選取的9種蔬菜均隨機在市場上抽取3份，并用液相色譜-串聯質譜法確認為陰性，再用膠體金快速試紙條進行檢測以驗證其假陽性率。液相色譜-串聯質譜法中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的檢出限分別為0.12、5.50、0.36 μg/kg。結果詳見表4，多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的假陽性率均為0。

2.3 實驗室加標假陰性率試驗 多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的靈敏度試驗中各選取的9種蔬菜均隨機在市場上抽取3份，并用液相色譜-串聯質譜法確認為陰性，再根據3種農藥的檢出限濃度進行加標驗證，多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的加標濃度分別為0.5、0.5、0.2 mg/kg。結果見表5，多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的假陰性率均為0。

2.4 實物陽性樣品 在試驗基地選擇生產過程中未使用過農藥的綠葉蔬菜，分別對其噴灑主要藥效成分為多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的農藥品種，噴灑后3 d采摘蔬菜運送到實驗室，先用儀器方法對樣品中農藥殘留的含量進行測定，再將樣品稀釋到產品最低檢出限的0.5、1.0、2.0倍水平。每種基質做3個平行，每個檢出水平做10個平行。驗證結果用《食品快速檢測方法評價技術規范》評價膠體金方法的靈敏度、特異性、假陽/陰性率和與參比方法一致性，結果如表6所示。實物陽性樣品驗證多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒殘留的假陰性率均為0，僅啶蟲脒在0.1 mg/kg測試濃度有2例假陽性，總體來看3種農藥的假陽性率分別為0、0和6.67%，但與參比方法均無顯著性差異（χ2<3.84）。

2.5 交叉反應測試 選擇噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺、嘧菌環胺、克百威、毒死蜱、阿苯達唑、甲氰菊酯、溴氰菊酯、百菌清、腐霉利、烯酰嗎啉共12種農藥開展交叉反應測試。將以上12種農藥配制成濃度均為20 μg/mL的混合標準儲備液，再將混合標準儲備液分別稀釋到1.00、0.50、0.20? mg/kg待用。然后分別用100根啶蟲脒膠體金試紙條測試1.00、0.50、0.20? mg/kg 的混合標準溶液，結果均為陰性;分別用100根吡蟲啉膠體金試紙條測試1.00、0.50、0.20 mg/kg的混合標準溶液，結果均為陰性;分別用100根多菌靈膠體金試紙條測試1.00、0.50、0.20 mg/kg的混合標準溶液，結果除阿苯達唑外均為陰性，而阿苯達唑與多菌靈的交叉反應率為100%。

3 討論與結論

近年來，我國農產品質量安全管理力度進一步加大，農產品質量安全水平不斷提升，但由于我國的蔬菜生產方式仍以家庭小農散戶為主，其農藥超標的問題還未徹底杜絕，蔬菜質量安全存在隱患。在眾多影響因素中，缺乏適于源頭生產者的自檢手段是關鍵因素之一。另外，目前我國政府部門的農產品質量安全監管工作中均采用儀器方法進行檢測，需要將樣品運送到專業實驗室才能開展工作，不僅檢測成本高、周期長，對操作人員的素質要求還很高，另外還會由于監測經費和檢測資源有限而降低抽樣比例，而抽樣比例越小風險就越大，因此該類檢測方法難以完全滿足日益嚴格的農產品質量安全監管需求。我國亟須要適于源頭農戶自檢和現場快速檢測的方法[12]。

該研究所報道的蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的膠體金快速檢測法可在15 min內完成一件樣品從前處理到讀取結果的全部檢測工作，檢測結果與液相色譜法串聯質譜法相比無顯著性差異，該方法更為簡便、快速和低成本，且其靈敏度較高，能滿足國家標準對多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的限量要求。因此可采用該方法開展蔬菜上市前的自檢或監測，可有效控制蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒超標。另外，膠體金快速檢測法操作簡便，無需專業人員檢測，適用于基層人員在田間地頭檢測，也符合政府管理部門及公眾呼吁的農產品質量安全從源頭管理的理念，適合推廣到基層開展蔬菜中多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒的快速檢測，但使用的過程中要注意排除多菌靈與阿苯達唑的交叉反應。

參考文獻

[1] 欒云霞，李楊，平華，等.基于酶抑制法的農藥殘留快速檢測儀器現狀及評價[J].食品安全質量檢測學報，2012，3（6）：690-694.

[2] 桑園園，柴麗娜，魏朝俊，等.酶抑制法檢測4 種辛辣蔬菜農藥殘留假陽性消除的研究[J].中國農學通報，2009，25（11）：60-64.

[3] 于基成，邊辭，趙娜，等.酶抑制法快速檢測蔬菜中有機磷農藥殘留[J].江蘇農業科學，2006（5）：170-172.

[4] 馮忠華，李躍龍，陳運勤，等.膠體金免疫層析技術及其在食品安全快速檢測中的應用[J].廣東飼料，2017，26（12）：39-40.

[5] 劉雅寧，袁寶鳳.農藥殘留膠體金檢測方法在蔬菜生產中的應用研究[J].陜西農業科學，2014，60（3）：67-68.

[6]? 肖文丹，楊肖娥，李延強.多菌靈在農田土壤中的降解及其影響因子研究[J].環境科學，2012，33（11）：3983-3989.

[7] 謝文，丁慧瑛，蔣曉英，等.液相色譜-串聯質譜檢測蔬菜和茶葉中吡蟲啉的殘留量[J].色譜，2006，24（6）：633- 635.

[8] TAILLEBOIS E，ALAMIDDINE Z，BRAZIER C，et al.Molecular features and toxicological properties of four common pesticides，acetamiprid，deltamethrin，chlorpyriphos and fipronil[J].Bioorganic & medicinal chemistry，2015，23（7）：1540-1550.

[9] 庾琴，周華，王靜，等.啶蟲脒在環境中的降解代謝及其安全性的研究進展[J].農藥，2007，46（4）：223-226.

[10] 國家衛和和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局，農業部.食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量：GB 2763—2019[S].北京：中國標準出版社，2020.

[11] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.水果和蔬菜中450種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法：GB/T 20769—2008[S].北京：中國標準出版社，2009.

[12] 李玉花.農產品農藥殘留快速檢測方法[J].云南農業，2016（4）：81-82.