35株非洲豬瘟病毒全基因組序列的系統(tǒng)生物學(xué)分析

于婷婷 陳江華 豐志華 張揚(yáng)帆 林章

摘?要：非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）源于非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）感染所引起的烈性傳染病，主要是以蜱和野豬為天然宿主。ASFV感染能夠?qū)е录邑i及野豬直接死亡，死亡率近乎100%。目前在非洲、歐洲、亞洲等地區(qū)均出現(xiàn)大面積爆發(fā)，卻尚未出現(xiàn)對(duì)該病毒進(jìn)行預(yù)防的商業(yè)化疫苗。因此，需要對(duì)病毒基因組信息有更深入的了解。通過(guò)對(duì)不同地區(qū)發(fā)生的ASFV全基因組進(jìn)行多序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、保守區(qū)域檢測(cè)等，獲得與ASFV毒力、進(jìn)化等相關(guān)的基因片段，并研究這些基因片段在不同區(qū)域的病毒株中的關(guān)系。結(jié)果表明： Ⅶ與Ⅱ基因型相比較，后者出現(xiàn)很多大片段基因序列的增加，這些增加的片段主要出現(xiàn)在V110、360、505/530多基因家族中。其中，對(duì)多基因家族中MGF 505/5307R、MGF 3601L基因研究分析表明，不同基因型之間由于這些基因的差異影響巨噬細(xì)胞的存活能力、病毒復(fù)制強(qiáng)弱與病毒變異和進(jìn)化有關(guān)，結(jié)果為研究病毒進(jìn)化及未來(lái)病毒疫苗研發(fā)提供新的方向。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒;全基因組序列;系統(tǒng)生物學(xué);病毒進(jìn)化

中圖分類號(hào)：S852.651?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：0253-2301（2020）05-0012-08

Abstract： African Swine Fever （ASF） is a severe infectious disease caused by the African Swine Fever Virus （ASFV）. The ticks and wild boars are the main natural hosts. The infection of ASFV can cause the direct death of domestic pigs and wild boars， with the death rate of nearly 100%. At present， the widespread outbreaks have occurred in Africa， Europe and Asia， but there was no commercial vaccine to prevent the virus. Therefore， a deeper understanding of viral genomic information was required. Through the multi-sequence alignment， the construction of phylogenetic tree， the detection of conserved region of ASFV whole genomes occurring in different regions， the gene fragments related to the virulence and evolution of ASFV were obtained， and then the relationship between these gene fragments in virus strains from different regions was also studied. The results showed that compared with the genotype Ⅶ， the genotype Ⅱ showed many increases in large fragment of gene sequence， most of which were found in the multigene family of V110， 360 and 505/530. Among them， the analysis of MGF 505/5307R and MGF 3601L genes in the multigene family showed that the differences of these genes among different genotypes would affect the survival ability of macrophages and the strength of virus replication was related to the variation and evolution of viruses. The results provided a new direction for the study of the evolution of viruses and the development of virus vaccines in the future.

Key words： African Swine Fever Virus; Whole genome sequence; Systematic biology; Viral evolution

非洲豬瘟病毒（African Swine Fever virus，ASFV）是一種大型多囊膜結(jié)構(gòu)的DNA病毒，主要感染豬單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并在細(xì)胞核周圍離散的病毒工廠內(nèi)進(jìn)行復(fù)制[1]。該病毒基因組為170～190 kbp的線性雙鏈DNA分子，編碼150多種多肽[2-3]。結(jié)構(gòu)上內(nèi)部由脂質(zhì)膜將基因組核心包裹，外部由二十面體蛋白衣殼和外部脂質(zhì)膜組成[1]。其中內(nèi)部脂質(zhì)膜由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜碎片組成，外部脂質(zhì)膜是由病毒胞吐期間在質(zhì)膜上發(fā)芽形成[4]。ASFV是目前唯一已知的DNA基因組的蟲(chóng)媒病毒[5]，是導(dǎo)致野豬、家豬高度致死，出血性疾病的病原體，并且在細(xì)胞內(nèi)外的ASFV均具有傳染性[4]。在近期研究中尚未有應(yīng)對(duì)非洲豬瘟的疫苗，因此急需對(duì)ASFV病毒基因組進(jìn)行全方面分析，以探究病毒在不同地區(qū)傳染過(guò)程中基因組發(fā)生的變化。

目前，對(duì)ASFV基因研究主要是病毒檢測(cè)方法、傳播途徑、入侵宿主的分子過(guò)程、病毒變異等，其中包括開(kāi)發(fā)最新PCR檢測(cè)法用于檢測(cè)ASFV[6];ASFV進(jìn)入宿主和體內(nèi)途徑的機(jī)制[7];病毒基因

MGF360、530對(duì)宿主干擾素影響[5];在Georgia株種敲除9GL和UK基因?yàn)橐呙缣峁﹨⒖嫉萚8]。盡管關(guān)于ASFV研究已有很多，但是大多數(shù)研究只是對(duì)單一區(qū)域ASFV進(jìn)行的研究，缺乏從不同區(qū)域、不同時(shí)間上對(duì)ASFV全基因組進(jìn)行縱向比較。

本研究主要從不同區(qū)域的ASFV全基因組層面上，使用生物信息學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)研究，相比對(duì)于單一病毒株的研究更具有意義。其次選擇全基因組數(shù)據(jù)分析，對(duì)比只關(guān)注于單個(gè)基因更具全面性。方法上選用MAFFT、MEGA軟件進(jìn)行多序列比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，MAFFT多重序列比對(duì)軟件與其他類型軟件相比速度和精度相對(duì)較高[9-10]。MEGA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)更加簡(jiǎn)潔、方便。經(jīng)過(guò)對(duì)比得到的差異片段使用CDD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行保守區(qū)域鑒定[11]。最后由Blast系列工具鑒定基因片段重復(fù)出現(xiàn)頻率及相似度，完成從基因組上對(duì)ASFV的研究。

1?數(shù)據(jù)來(lái)源與分析方法

由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）獲得全部的非洲豬瘟全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，并收集相關(guān)的病毒類型、病毒發(fā)生地和時(shí)間等。

為描述所收集到非洲豬瘟的樣本數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，通過(guò)MAFFT、MEGA進(jìn)行全基因組序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。與使用部分片段進(jìn)行比對(duì)，能夠直接獲得更多基因片段的取代、插入、缺失等信息，并且依靠全基因組所構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)也更加可靠。構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)使用最大似然法（ML）從全基因組層面進(jìn)行計(jì)算，與依據(jù)P72基因構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行病毒基因分型使用的方法一致[12-13]。

MAFFT軟件使用mafftautothread 32 in.file>out.file命令進(jìn)行全基因組序列比對(duì)，其中in.file為輸入文件out.file為比對(duì)結(jié)果輸出文件，結(jié)果文件中包含序列詳細(xì)的比對(duì)信息。根據(jù)結(jié)果文件相互比較結(jié)果中存在取代、插入、缺失信息的片段進(jìn)行檢驗(yàn)：（1）對(duì)于缺失較大片段通過(guò)CDD（CDD保守域數(shù)據(jù)庫(kù)能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)特定結(jié)構(gòu)域、保守區(qū)域、注釋信息進(jìn)行篩查，CDD保守區(qū)域檢索可以使用NCBI提供的在線數(shù)據(jù)庫(kù)，也可以通過(guò)本地構(gòu)建的保守序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索）進(jìn)行驗(yàn)證，確定是否是大片段蛋白插入形成新的基因類型;（2）缺失較小片段由Blast工具進(jìn)行檢索，驗(yàn)證小片段基因的來(lái)源。先由Makeblastdb命令構(gòu)建35株病毒庫(kù)，其次使用Blastn命令對(duì)自建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索;（3）其他差異片段從NT/NR數(shù)據(jù)庫(kù)尋找來(lái)源信息。

2?結(jié)果與分析

2.1?系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

通過(guò)NCBI獲得40多種非洲豬瘟的全基因組數(shù)據(jù)，對(duì)這些數(shù)據(jù)中未驗(yàn)證的數(shù)據(jù)進(jìn)行剔除，最終得到35種基因組數(shù)據(jù)、基因型信息（表1）[12-15]。使用MAFFT、MEGA軟件比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，描述35種不同基因組數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。并結(jié)合對(duì)ASFV基因型研究，繪制進(jìn)化樹(shù)和基因分型關(guān)系圖（圖1），發(fā)現(xiàn)亞洲地區(qū)與歐洲地區(qū)病毒基因型相同，并且與使用全基因構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分類一致。在進(jìn)化樹(shù)中出現(xiàn)最早的病毒可能是馬拉維Ⅷ基因型，同時(shí)Ⅰ與Ⅳ基因型在全基因組層面上具有一定的相似性。

2.2?CDD保守區(qū)域檢索

根據(jù)進(jìn)化樹(shù)將同一分支、不同分支之間進(jìn)行相互比較，發(fā)現(xiàn)在同一分支內(nèi)基因組相差異小，但對(duì)于不同分支之間差異大。其中Ⅱ與Ⅷ基因型比較結(jié)果差異較大，兩者相比存在很多缺失、差異片段。因此對(duì)這兩株中較大缺失片段進(jìn)行CDD檢索，大多數(shù)差異片段出現(xiàn)在V110、360、505/530多基因家族中。由于MGF 505/5307R、MGF 3601L基因影響宿主干擾素、促進(jìn)巨噬細(xì)胞存活等[16-17]，因此選擇MGF 505/5307R、MGF 3601L基因?yàn)橹饕獙?duì)象，并通過(guò)CDD檢索比較，繪制出該基因MGF 505/5307R蛋白保守區(qū)域圖（圖2）。

2.3?MGF 505/5307R與MGF 3601L基因重復(fù)片段檢測(cè)

為研究Ⅷ基因型中缺失片段在35株中存在的總體情況，使用Makeblastdb工具對(duì)35株ASFV全基因組構(gòu)建核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，由Blastn命令對(duì)所有株型中進(jìn)行檢索得到統(tǒng)計(jì)信息（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ASFV中可能存在2～4個(gè)重復(fù)片段，與Ⅱ基因型各個(gè)片段基本沒(méi)有差異，在Ⅰ、Ⅹ、Ⅸ、Ⅳ基因型中存在15%左右的差異，和基因型Ⅷ相比差異最大。

同時(shí)也發(fā)現(xiàn) MGF 3601L 基因在比較中也存在類似差異（表3）。與Ⅱ基因型各個(gè)片段基本沒(méi)有差異，在部分Ⅹ基因型、部分Ⅰ基因型和Ⅳ基因型中沒(méi)有重復(fù)片段，Ⅸ基因型有大概15%的差異。

3?討論與結(jié)論

ASFV最早是1920年在肯尼亞報(bào)道[18]，20世紀(jì)中葉蔓延到歐洲再到南美、加勒比海，1990年在歐洲對(duì)所有野豬、家豬進(jìn)行捕殺，以達(dá)到將ASFV規(guī)模根除的目的[1]。但2007年該病毒再次從非洲傳播到高加索地區(qū)、波蘭等地區(qū)[19]，并在2018年傳入中國(guó)，并帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[20]。因此目前急需解決的是在防治方面得到突破。本研究從生物信息分析角度出發(fā)，利用現(xiàn)有的軟件、數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)在病毒基因組中存在的潛在規(guī)律，為未來(lái)ASFV研究提供一定的參考信息。采用MAFFT進(jìn)行多序列比對(duì)、MEGA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、Blast比對(duì)重復(fù)序列等，得到基因與病毒發(fā)生時(shí)間、進(jìn)化方式之間的關(guān)系。

研究中構(gòu)建35株ASFV全基因組構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)，與前期研究中根據(jù)P72基因所構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)大體一致[12]。但在全基因組構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)中，Ⅷ型為最早的原始株，同時(shí)推斷出由Ⅷ型突變衍生出其他基因型。進(jìn)化樹(shù)中I型與Ⅳ型基因型被劃分在同一分支中，表明二者在全基因組上相近。為此猜想Ⅳ型可能是由Ⅰ型突變或重組得到。進(jìn)一步結(jié)合進(jìn)化樹(shù)和分布區(qū)域的信息，發(fā)現(xiàn)Ⅱ與部分Ⅰ、Ⅸ型基因型同一分支，可能是部分Ⅰ型與Ⅸ型重組得到，同時(shí)也符合區(qū)域分布、傳染信息等。

全基因組進(jìn)化樹(shù)中，將分支最遠(yuǎn)的兩個(gè)基因型Ⅱ與Ⅷ全基因組進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)Ⅷ基因組中存在很多缺失、差異片段。經(jīng)過(guò)CDD檢索大多數(shù)缺失片段為V110、360、505/530多基因家族。進(jìn)一步說(shuō)明這些缺失片段可能與病毒存活能力、復(fù)制能力有關(guān)。綜合ASFV前期研究，多基因家族中MGF 505/5307R、MGF 3601L基因，對(duì)宿主干擾素產(chǎn)生、促進(jìn)巨噬細(xì)胞存活等具有一定的影響[17]。對(duì)35株中這兩種基因片段相似度、重復(fù)情況進(jìn)行檢索統(tǒng)計(jì)。發(fā)現(xiàn)Ⅱ型基因型具有全部基因型出現(xiàn)的重復(fù)片段，并且相似度較高。在進(jìn)化樹(shù)中隨著距離Ⅱ型分支越遠(yuǎn)逐漸出現(xiàn)部分片段缺失、相似度降低。綜合35株不同區(qū)域、不同基因型的圖譜信息及爆發(fā)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)隨著病毒不斷傳播，在新地區(qū)出現(xiàn)病毒復(fù)制能力強(qiáng)弱程度，以及其他文獻(xiàn)研究報(bào)道則表明505/530、360多基因家族的功能。說(shuō)明ASFV中505/530、360多基因家族重復(fù)片段數(shù)量，與病毒存活能力、復(fù)制息息相關(guān)。以及在Ⅱ型基因型中MGF 505/5307R、MGF 3601L出現(xiàn)的重復(fù)片段，可能是早期基因型出現(xiàn)重組的結(jié)果。

在ASFV防治方面，是否通過(guò)對(duì)505/530、360多基因家族產(chǎn)生影響，獲得弱毒病毒株以加快疫苗的研制。同時(shí)在病毒進(jìn)化方面，提供了基因變化與病毒變異、進(jìn)化關(guān)系，為進(jìn)一步研究病毒進(jìn)化和預(yù)防等提供更多的證據(jù)，也為未來(lái)ASFV疫苗研發(fā)提供新方向。

參考文獻(xiàn)：

[1]GALINDO I，ALONSO C.African Swine Fever Virus：A Review [J].Viruses，2017，9（5）：103.

[2]YANEZ R J，RODRIGUEZ J M，NOGAL M L，et al.Analysis of the Complete Nucleotide Sequence of African Swine Fever Virus[J].Virology，1995，208（1）：249-278.

[3]HERNAEZ B，ESCRIBANO J M，ALONSO C.Visualization of the African swine fever virus infection in living cells by incorporation into the virus particle of green fluorescent proteinp54 membrane protein chimera[J].Virology，2006，350（1）：1-14.

[4]SALAS M L，GERMAN A.African swine fever virus morphogenesis[J].Virus Research，2013，173（1）：29-41.

[5]AFONSO C L，PICCONE MEZAFFUTO K M， NEILAN J，et al.African swine fever virus multigene family 360 and 530 genes affect host interferon response[J].Journal of Virology，2004，78（4）：1858.

[6]LUO Y，ATIM S A，SHAO L，et al.Development of an updated PCR assay for detection of African swine fever virus[J].Archives of Virology，2016，162（1）：191-199.

[7]SNCHEZ E G，PREZ-NEZ D，REVILLA Y.Mechanisms of Entry and Endosomal Pathway of African Swine Fever Virus[J].Vaccines，2017，5（4）：42.

[8]O′DONNELL V，RISATTI G R，HOLINKA L G，et al.Simultaneous deletion of the 9GL and UK genes from the African swine fever virus Georgia 2007 isolate offers increased safety and protection against homologous challenge[J].Journal of Virology，2017，91（1）：e01760-16.

[9]WONG K M，SUCHARD M A，HUELSENBECK J P.Alignment uncertainty and genomic analysis[J].Science，2008，319（5862）：473-476.

[10]KUMAR S，STECHER G，TAMURA K.MEGA7：Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets[J].Molecular Biology & Evolution，2016，33（7）：1870-1874.

[11]ARON M B，DERBYSHIRE M K，GONZALES N R，et al.CDD：NCBI′s conserved domain database[J].Nucleic Acids Research，2015，43（Database issue）：D222-D226.

[12]VILLIERS E P，DE，CARMINA G，MARISA A，et al.Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever virus genome sequences[J].Virology，2010，400（1）：128-136.

[13]BASTOS A D S，PENRITH M L，CRUCIRE C，et al.Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation[J].Archives of Virology，2003，148（4）：693-706.

[14]BISHOP R P，F(xiàn)LEISCHAUER C，VILLIERS E P D，et al.Comparative analysis of the complete genome sequences of Kenyan African swine fever virus isolates within p72 genotypes IX and X[J].Virus Genes，2015，50（2）：303-309.

[15]BOSHOFF C I，BASTOS A D，GERBER L J，et al.Genetic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa（1973-1999）[J].Veterinary Microbiology，2007，121（1）：45-55.

[16]CHRISTOPHER N，ISABELLE R，THOMAS W.The subcellular distribution of multigene family 110 proteins of African swine fever virus is determined by differences in C-terminal KDEL endoplasmic reticulum retention motifs[J].Journal of Virology，2004，78（7）：3710-3721.

[17]AFONSO C L，PICCONE M E，ZAFFUTO K M，et al.African Swine Fever Virus Multigene Family 360 and 530 Genes Affect Host Interferon Response[J].Journal of Virology，2004，78（4）：1858-1864.

[18]MONTGOMERY R E.On a form of swine fever occurring in British East Africa（Kenya Colony） [J].Journal of comparative pathology & therapeutics，1921，34：159-191.

[19]WOZNIAKOWSKI G，KOZAK E，KOWALCZYK A，et al. Current status of African swine fever virus in a population of wild boar in eastern Poland（2014-2015）[J].Archives of Virology，2016，161（1）：189-195.

[20]GE S，LI J，F(xiàn)AN X，et al.Molecular Characterization of African Swine Fever Virus， China， 2018[J].Emerging infectious diseases，2018，24（11）：2131-2133.

（責(zé)任編輯：柯文輝）