茶渣固態發酵產紅曲霉色素的工藝參數探索

周昀

摘?要：對茶渣固態發酵產紅曲霉色素工藝條件進行優化。在單因素試驗基礎上，以硫酸銨、茶渣、大豆油添加量為影響因素，以紅曲色素總色價為響應值，采用BoxBehnken中心組合試驗設計數學模型，優化茶渣固態發酵產紅曲霉色素的培養條件。結果表明：影響茶渣固態發酵產紅曲霉色素的因素大小依次為硫酸銨、大豆油、茶渣;茶渣固態發酵產紅曲霉色素的最佳培養條件為硫酸銨添加量1.66%、茶渣添加量35.37%、大豆油添加量2.4%以及接種量3%，根據模型預測的總色價為（1076.4±30.2）U·g-1。進行重復驗證試驗，經測定實際所得總色價為1063 U·g-1，總色價實測值與回歸模型的預測值相對誤差1.26%，說明回歸方程與實際情況擬合較好。

關鍵詞：茶渣;紅曲霉;紅曲色素;固態發酵

中圖分類號：TS209?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）08-0001-06

Abstract： The technological conditions of producing the Monascus pigment by solidstate fermentation of tea residue were optimized. On the basis of the single factor experiment， with the ammonium sulfate， tea residue and soybean oil as the influencing factors and the total color value of Monascus pigment as the response value， the BoxBehnken central composite design was used to design a mathematical model， in order to optimize the culture conditions for the production of Monascus pigment by solidstate fermentation. The results showed that the factors affecting the production of monascus pigment by solidstate fermentation of tea residue were the ammonium sulfate， soybean oil and tea residue in order. The optimum culture conditions for producing the Monascus pigment by solidstate fermentation of tea residue were the ammonium sulfate （1.66%）， tea residue （35.37%）， soybean oil （2.4%） and inoculation amount （3%）. And the total color value predicted by the model was （1076.4±30.2）U·g-1. Then， the repeated verification tests were carried out and the actual total color value was determined to be 1063 U·g-1. The relative error between the measured value of total color value and the predicted value of the regression model was 1.26%， indicating that the regression equation fit well with the actual situation.

Key words： Tea residue; Monascus; Monascus pigment; Solidstate fermentation

紅曲霉產的紅曲色素作為一種天然色素，廣泛使用在食品加工業中[1]。紅曲色素目前已確定結構的有紅曲紅、紅曲橙和紅曲黃3種，與其他色素相比具有降血脂、降血壓等生理活性，且穩定性高，著色力強等優勢[2]，開發色價高的紅曲色素成為近年來紅曲霉產物的研究熱點。與此同時，由于茶葉中含有較多的營養成分，作為傳統飲料，制作茶葉、茶飲料生產中產生了大量廢棄茶葉副產品。茶渣中保留了大量纖維素、木質素、茶多酚、氨基酸及微量元素等有效成分，具有潛在利用價值[3]。福建省作為產茶大省，茶葉消費副產品相當巨大，茶渣等再利用的研究對促進福建省農業殘余產業發展具有重要意義。本研究以茶渣為固態發酵基質，對其固態發酵產紅曲霉色素的工藝進行優化，以期為茶渣的合理開發利用提供參考依據。

1?材料與方法

1.1?供試材料

1.1.1?菌種?紅曲霉菌株S2：由本實驗室篩選保藏。

1.1.2?主要儀器?6孔圓形深孔板（上海聯碩生物科技有限公司）;T6型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;hh6數顯恒溫水浴鍋（常州金壇宏華儀器廠）;LRH生化培養箱（上海恒科學儀器公司）;VD850型潔凈工作臺（蘇州凈化設備公司）;YB500A高速多功能粉碎機（上海力箭機械有限公司）;Readmax1900全波長酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）。

1.1.3?主要試劑?可溶性淀粉、麥芽糖、蛋白胨、瓊脂、K2HPO4、NaNO3、KCl、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、硫酸銨、酵母浸粉、蔗糖、甘油、牛肉浸膏、70%乙醇（73.7 mL 95%乙醇用超純水定容到100 mL），均為國產分析純試劑。茶碎茶梗及豆粕購自網絡平臺，金龍魚食用油購自超市。

1.2?培養基

1.2.1?微量元素配方?0.3%NaNO3、0.1% ZnSO4·7H2O、0.1% MgSO4·7H2O、0.2%K2HPO4。

1.2.2?斜面培養基?PDA培養基：馬鈴薯去皮，切成小塊，稱200 g加水1 L，煮沸保持30 min，4層紗布過濾去渣，濾液加入瓊脂20 g、葡萄糖20 g，加熱溶解，定容至1 L。分裝到試管中，硅膠塞封口包扎好后于121℃高壓滅菌30 min。取出后試管擺斜面，冷卻后留存備用。

1.2.3?固體發酵培養基?取20 g茶碎茶梗略粉碎后加少量超純水浸泡10 min后濾去水分得到茶渣，另加入45 g超純水及上述微量元素浸泡過夜，添加額外氮源后倒入250 mL三角燒瓶內于121℃高壓滅菌30 min。使用6孔深孔板時，配置同等比例的料水后分別于每孔中添加8 g料水，121℃高壓滅菌30 min。

1.3?試驗方法

1.3.1?斜面培養及菌懸液的制備?保藏的紅曲霉接種于斜面培養基，在30℃培養箱中活化7 d;刮下斜面上孢子轉移到另一個含有10 mL的生理鹽水試管中，振蕩5 min形成菌懸液。

1.3.2?單因素試驗?單因素試驗均以單純茶渣固體培養基、不添加氮源及紅曲菌的樣品作為參比樣。

（1）不同氮源類型對紅曲霉產色素的影響。在固體發酵培養基基礎上，分別額外添加1.5%的氮源（蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨及豆粕，其他氮源以蛋白胨含氮量折算）。以1.5%接種量接入菌懸液，30℃下靜置培養7 d。

（2）不同氮源添加量對紅曲霉產色素的影響。在固體發酵培養基基礎上，分別額外添加1%、1.5%、2.5%和3%的（NH4）2SO4。以1.5%接種量接入菌懸液，30℃下靜置培養7 d。

（3）不同茶渣添加量對紅曲霉產色素的影響。在固體發酵培養基基礎上，采用額外添加1.5%氮源硫酸銨，分別添加25%、30%、35%和40%茶碎茶梗。以1.5%接種量接入菌懸液，30℃下靜置培養7 d。

（4）不同食用油添加量對紅曲霉產色素的影響。在固體發酵培養基基礎上，采用額外添加1.5%氮源硫酸銨和35%的碳源茶碎茶梗，分別添加1%和2%大豆油。以1.5%接種量接入菌懸液，30℃下靜置培養7 d。

（5）不同接種量對紅曲霉產色素的影響。在6孔板固體發酵培養基基礎上，采用額外添加1.5%硫酸銨（氮源）和35%茶碎茶梗（碳源），在每孔分別添加1%、3%、5%和10%菌懸液，30℃下靜置培養7 d。

1.3.3?茶渣培養基正交試驗?使用JMP13軟件設計BoxBehnken中心組合試驗，試驗設計因素及水平列于表1。以硫酸銨（氮源）、茶渣（碳源）和大豆油添加量為3個因子自變量，紅曲色素總色價為響應值。使用JMP13軟件對響應面結果進行逐步回歸分析。

1.3.4?發酵產物色價的測定?取發酵物0.5 g，以超純水或70%乙醇定容至10 mL，60℃恒溫水浴鍋中浸提1 h后超聲振蕩及過濾。取濾液0.5 mL用超純水或70%乙醇適當稀釋后分別在410、465、510 nm處測定吸光度值分別為黃、橙和紅的色價。6孔板培養時使用全波長酶標儀進行色價的測定，制備待測樣方法一致。總色價=（OD410+OD465+OD510）×稀釋倍數[4]。

2?結果與分析

2.1?不同氮源類型對紅曲霉產色素的影響

由圖1可知，無額外添加氮源的條件下紅曲霉產醇溶性和水溶性色素均很少，可能是因為茶葉本身的含氮量只有3.5%～4.5%[5]，經過浸泡后流失部分水溶性氨基酸使殘留的茶蛋白含量更低，不足以支持紅曲霉對氮源的需求。水溶性色素產量甚少，故此后僅測定醇溶性色素含量。而各氮源對紅曲霉產醇溶色素的促進作用為硫酸銨>牛肉浸膏>蛋白胨>酵母浸粉>豆粕，以唯一無機氮源硫酸銨的效果最佳，醇溶性色素的產量可達到274 U·g-1，為未添加額外氮源參比樣的5.5倍左右。有機氮源中牛肉浸膏的效果較好，但鑒于價格考慮，硫酸銨無疑是外加氮源的最佳選擇。

2.2?不同硫酸銨添加量對紅曲霉產色素的影響

由圖2可知，硫酸銨添加量為1.5%時，3種醇溶性色素總產量可達222 U·g-1，低于或高于1.5%添加量都會造成醇溶性色素生成的減少。過高的氮源反而會抑制3種醇溶色素的產生，可能和促進菌體生長而抑制了代謝產物的產生有關。

2.3?不同茶渣添加量對紅曲霉產色素的影響

由圖3可知，茶渣占發酵物總質量的35%時，3種醇溶性色素的產量最高（紅色素191.4 U·g-1、橙色素109.8 U·g-1、黃色素62.2 U·g-1，總色素量363.4 U·g-1）。但茶渣量并非越多越好，當其占比為40%時，由于水分含量降低且茶葉吸水性較強，導致發酵物較干，不利于紅曲霉的發酵，所產醇溶性色素比添加30%茶渣時低。

2.4?不同大豆油添加量對紅曲霉產色素的影響

由于周波等[6]在之前的研究中發現使用食用植物油確實可以促進液態發酵紅曲霉色素的產量，故在茶渣培養基基礎上添加了不同含量的大豆油進行試驗。由圖4可知，添加植物食用油可以促進紅曲霉產醇溶性色素，且隨著食用油添加量增加色素有增長的趨勢，在添加總量為2%的大豆油后醇溶性色素產量達到811 U·g-1。

2.5?不同接種量對紅曲霉產色素的影響

由圖5可知，過多接種量對于紅曲霉產色素不利，可能是菌株之間競爭營養抑制了色素的產生，這種效應在容量較小的深孔板培養環境中體現得更加明顯，添加3%菌懸液時3種醇溶性色素的產量都達到峰值（總產量972 U·g-1）。

2.6?BoxBehnken中心組合試驗結果

2.6.1?回歸方程分析?BoxBehnken中心組合試驗設計結果列于表2。根據表2試驗結果，以總色價（Y）為響應值，以標準最小二乘法進行二次回歸方程擬合，得到總色價（Y）的回歸方程，即Y=-12218.014+3849.44X1+562.93X2+139.56X3-798.61X12-7.18X22-29.16X32 -33.89X1X2。

回歸分析及方差分析結果見表3，由表3可知，模型P<0.0001，表明回歸模型高度顯著。該模型的相關系數R2=0.97，說明擬合程度極好，可用于后續茶渣發酵紅曲霉色素的產量預測所用。對回歸方程的各項方差進一步檢驗可知，X1、X2、X3三因素對紅曲色素產量的影響強度順序為硫酸銨添加量（X1）>大豆油添加量（X3）>茶渣添加量（X2）。因素X1、X3及二次項

X12、X22、X32對總色價具有極顯著影響（P<0.01），因素X2及交互項X1X2對總色價具有顯著影響（P<0.05）。

2.6.2?響應面雙因子效應分析及預測刻畫器?從圖6～8的雙因子效應分析中可知，3個因素的交互作用顯著，且根據JMP軟件特有的預測刻畫器可以調節相關因素得到預測的總色價。由圖9可得最佳培養條件為硫酸銨添加量1.66%、茶渣添加量35.37%、大豆油添加量2.4%以及接種量3%，根據此預測所得的總色價為（1076.4±30.2）U·g-1，與代入回歸方程所得總色價1076.37 U·g-1一致。

2.7?驗證試驗

為確定建立模型與試驗結果是否相符，采用最佳培養條件添加1.66%硫酸銨、35.37%茶渣和2.4%大豆油，接種量為3%時進行可靠性重復試驗3次。經測定實際所得紅曲霉色素總色價為1063 U·g-1，與模型預測范圍相差不大，說明模型設計合理，預測結果準確。

3?結論

本研究采用單因素試驗對氮源類型、硫酸銨、茶渣、大豆油添加量及接種量進行篩選研究，試驗結果表明外加氮源能明顯促進茶渣培養基中紅曲霉產色素，其中硫酸銨的效果最為明顯，而醇溶性色素的產量又明顯高于水溶性色素，硫酸銨添加量為1.5%時所產醇溶性色素最高。茶渣作為唯一的碳源，其添加量在35%時醇溶性色素產量最高，說明紅曲菌具有分解纖維素和木質素轉變成還原糖的能力，其纖維素酶活性的測定是后續研究工作的重點。添加食用大豆油確實會增加醇溶性色素的產量，且產量與添加量成正比。在單因素試驗基礎上采用響應面法優化茶渣固態發酵產紅曲霉素工藝條件為硫酸銨1.66%、茶渣35.37%、大豆油2.4%及接種量3%，在此最佳工藝條件下紅曲霉產醇溶性色素可達1063 U·g-1。茶渣色素產量與其他糧食類固體培養基的色素產量[7]相比較低，這可能是因為糧食類培養基的碳源利用更加容易，而茶渣中的碳水化合物以纖維素為主。在今后研究中可考慮添加外源性纖維素酶提高茶渣培養基的利用率。

參考文獻：

[1]FENG Y I，SHAO Y C，ZHOU Y X，et al.Effects of glycerol on pigments and monacolin K production by the high monacolin K producing but citrinin free strain，Monascus pilosus MS1[J].

European Food Research Technology，2015，240（3）：635.

[2]梁彬霞，白衛東，楊曉暾，等.紅曲色素的功能特性研究進展[J].中國釀造，2012，31（3）：21-24.

[3]肖正廣，周國蘭.茶渣的綜合利用及研究進展[J].貴州茶葉，2017，45（4）：23-25.

[4]呂旭聰，翁星，韓妙坤，等.福建紅曲中紅曲菌的分離鑒定及菌株特性研究[J].中國食品學報，2012，12（2）：88-97.

[5]顧謙，陸錦時，葉寶存.茶葉化學[M].合肥：中國科學技術大學出版社，2005：66.

[6]周波，鐘海雁，林親錄.食用植物油對紅曲黃色素合成代謝的影響[J].食品工業科技，2012（13）：92-95.

[7]童愛均，呂旭聰，劉曉艷，等.固體發酵基質和外加碳氮源對紅曲霉色素產量的影響[J].中國調味品，2015（5）：5-10.

（責任編輯：林玲娜）