新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)采樣方法的現狀與展望

嚴新忠，洪大富, ，程 智，李 抄，周衛斌，杜耀華

(1. 天津科技大學電子信息與自動化學院，天津300222；2. 軍事科學院系統工程研究院衛勤保障技術研究所，天津300171)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)具有很強的傳播性和致病性，該病毒作用于呼吸道或消化道上皮細胞，經血液循環至肺部，對肺臟功能細胞進行攻擊，最終引發病毒性肺炎[1-2].新型冠狀病毒主要通過兩種傳播方式實現對人員的感染[3-7]：(1)接觸傳播，即通過肢體接觸后再經呼吸道或消化道完成傳播感染；(2)氣溶膠傳播，即病毒附著在灰塵、水汽等氣溶膠上完成傳播感染[8-9].

對確診病人進行一些容易產生氣溶膠的操作會增加傳播冠狀病毒(嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒)的風險，例如氣管插管、無創通氣、氣管切開術、心肺復蘇、插管前人工通氣和支氣管鏡檢查等.

新型冠狀病毒的環境采樣為檢測分析提供了樣品保障.在隔離留觀區和隔離重癥監護病區等區域，患者通過呼吸向周圍環境輸出新型冠狀病毒.在采集呼吸道標本、氣管插管、氣管切開、無創通氣、吸痰等可能出現血液、體液和分泌物噴濺的處置操作區，應著重關注冠狀病毒氣溶膠的存在情況，有效采取相關采樣手段對環境進行采樣分析.

對感染者接觸環境的新型冠狀病毒進行高效采樣是合理制定相關防御措施和切斷病毒傳播途徑的關鍵.本文基于傳統病毒采樣方法與新型冠狀病毒的物性特征，總結新型冠狀病毒的固態附著、液態攜帶和生物氣溶膠3種形式下的采樣方法.

1 新型冠狀病毒的采樣方法

新型冠狀病毒屬于β屬冠狀病毒，病毒顆粒的外形特征呈球形或橢球型，常為多形性，其粒徑為 60～140nm，通過透射電鏡對感染者呼吸道上皮超薄切片進行表征觀察，可發現細胞外游離著新型冠狀病毒顆粒，同時在細胞質中也觀察到囊泡膜包裹的病毒顆粒[10].新型冠狀病毒在感染者接觸環境內的存在形式主要有固態附著形式、液態攜帶形式和生物氣溶膠形式.針對不同的存在形式，應采取不同的采樣方法，以達到最佳采樣效果.

1.1 固態附著形式

新型冠狀病毒的固態附著形式是指新型冠狀病毒附著于固體表面的存在形式，如感染者使用過的門把手(2020年2月3日，廣州市疾控中心在一名確診患者家中門把手上發現新型冠狀病毒的核酸)、電梯按鈕、水杯等.

此類存在形式的新型冠狀病毒可以通過棉拭子涂抹法[11]和濾紙條粘貼法[12]進行采樣.

棉拭子涂抹法：將無菌棉簽在含 3mL中和劑采樣液的 15mL離心管中沾濕，對檢測目標表面約5cm×5cm區域進行涂抹采樣，橫豎往返各8次，覆蓋整個采樣區域，采樣完成后以無菌操作方式將棉簽采樣端剪入原采樣管內.針對表面足夠且規整的目標污染區可按該方法在表面不同位置進行采樣，對于表面積小于 5cm×5cm 的物體(如 EP管等)采樣范圍覆蓋整個表面，對表面不規則部位(如儀器內部部位等)采樣應盡量覆蓋足夠面積.

濾紙條粘貼法：將滅菌濾紙條放于無菌平皿內，加少量滅菌生理鹽水潤濕，平貼于疑似病毒污染面，1min后取下，放入50mL生理鹽水中.

1.2 液態攜帶形式

新型冠狀病毒的液態攜帶形式是指新型冠狀病毒存在于懸濁液或污水中，如感染者的唾液、痰、尿液及感染者使用過的廢水等.

針對唾液、痰等小體積液態附著物中攜帶的新型冠狀病毒可以通過棉拭子涂抹法進行取樣，其操作步驟與固態附著形式基本相同，在此不多贅述.

液態攜帶形式的新型冠狀病毒還可以采用滴管采樣法進行采樣，即用滴管吸取可疑液體，注入預先裝有 200μL PBS緩沖液的采樣管中，封管后完成采樣.

除此兩種方法外，針對大體積容量污水中的新型冠狀病毒采樣可以采用超濾膜富集法[13-15]，即：使用孔徑為 0.22μm的濾芯過濾，去除采樣液中的細菌等雜質，再使用超濾膜富集可能存在的新型冠狀病毒粒子.

1.3 生物氣溶膠形式

新型冠狀病毒的生物氣溶膠形式是指新型冠狀病毒經感染者體內排出后附著在灰塵、水汽等微小顆粒上形成病毒型生物氣溶膠.與常規生物氣溶膠相比，病毒型生物氣溶膠具有更強的不穩定性、傳播性和致病性.

相比于固態附著形式和液態攜帶形式，生物氣溶膠形式的新型冠狀病毒更容易隨著自然風和氣流進行擴散，從而具有更強的傳播能力和致病能力.因此，對生物氣溶膠形式的新型冠狀病毒進行采樣至關重要.

生物氣溶膠形式的新型冠狀病毒采樣方法可分為被動采樣法和主動采樣法[16]兩類.

1.3.1 被動采樣法

最典型的被動采樣法是自然沉降法[17]，該方法常用來評估微生物對檢測對象表面污染.其具體采樣過程：將直徑為 90mm 的采樣板置于離地面 1m以上(通常選擇人體呼吸帶 1.5m 位置)，距墻面 1m以上的位置上，暴露 1h以上.該方法可以用來評價大氣中微生物污染程度，從采樣結果可以得到大氣中微生物污染指數(IMA).但據研究表明，用此方法進行采樣得到的 IMA略低于真實值，不能準確地反映空氣中新型冠狀病毒的實際濃度，采樣效率較低，因此不作為傳染性病毒的主要采樣方法[18].

1.3.2 主動采樣法

主動采樣法是借助外力提高新型冠狀病毒采樣效率和采樣精度的采樣方法.此類方法主要有過濾法、沖擊法、撞擊法、氣旋法、靜電法、溫差迫降法和虛擬濃縮法等.

過濾法[19]是通過過濾阻留器進行采樣，過濾阻留器通過抽氣裝置將空氣吸入采樣口，通過擴散、慣性碰撞和吸附作用阻留新型冠狀病毒粒子，使其附著在濾膜上，從而達到采樣目的.常用的濾膜材料有硝酸纖維素酯、明膠等，濾膜濾孔一般為 0.01～10μm，采樣流量1～50L/min，采樣時間一般不超過30min.

沖擊法[20]是采用噴射氣流管使新型冠狀病毒生物氣溶膠氣流通過采樣液(如生理鹽水、PBS緩沖液等)，氣流中攜帶的病毒粒子會在采樣液的黏滯力作用下被捕獲，完成收集采樣.采用這種方法的代表性采樣器有全玻璃液體撞擊式 AGI-30型和Biosampler型采樣器，AGI-30型采樣器的采樣流量為 12.5L/min，適用于 15～30min的采樣；Biosampler型采樣器在相同的采樣流量下使用非揮發性采樣液進行采樣，采樣時間可以達到 8h.圖 1為液體沖擊式采樣器.

圖1 液體沖擊式采樣器Fig. 1 Liquid impact bioaerosols sampler

撞擊法[21-23]是采用氣流通道使新型冠狀病毒生物氣溶膠氣流撞擊培養皿，在慣性和重力的作用下，新型冠狀病毒粒子會滯留在固體培養基上，從而達到采樣目的.此方法最具代表性的采樣器是 Anderson型六級采樣器(圖 2)，其采樣流量為 28.3L/min.這種方法的局限性在于病毒粒子經撞擊后會有較大概率發生輕微破損，采樣時間過長還容易導致培養基脫水，以致降低生物活性.在采集過程中應考慮新型冠狀病毒的生存方式，新型冠狀病毒需要活體細胞作為載體，因此采樣器內的培養基不能采樣常規的瓊脂培養基，應采用血漿凝塊培養基作為采集載體.采樣工作結束后對血漿凝塊進行新型冠狀病毒核酸檢測[24].

氣旋法[25-26]是通過氣流管將新型冠狀病毒生物氣溶膠引入采樣器，在旋風、慣性和重力等作用下，采樣杯內的液體會潤濕采樣杯壁面，同時氣流中的新型冠狀病毒粒子會沿著壁面做向心運動，最終被采樣液的黏性力吸附，完成收集采樣.此方法最具代表的采樣器是法國的 Coriolis生物氣溶膠采樣器(圖 3)，其采樣流量能夠達到 300L/min，適合大流量采樣工作.

圖2 Anderson六級采樣器Fig. 2 Anderson sampler

圖3 Coriolis生物氣溶膠采樣器Fig. 3 Coriolis bioaerosols sampler

靜電法[27-28]是對既定空氣環境施加高壓靜電，使空氣中的新型冠狀病毒生物氣溶膠帶電，再用帶有相反電荷的采樣面進行吸附.但是，此方法對新型冠狀病毒具有一定的破壞性，會影響后續檢測分析. Piri等[29]經過大量的實驗，證明了在放電過程中會產生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，該物質會溶于采樣液中，并對采樣液中的生物氣溶膠造成破壞.

溫差迫降法[30]是利用新型冠狀病毒生物氣溶膠粒子的熱泳原理進行采樣，采樣過程復雜，采樣環境需冷卻，因此僅適用于實驗室.

虛擬濃縮法[31-33]是運用離心力和慣性分離將大流量空氣中的新型冠狀病毒生物氣溶膠粒子富集到小流量中，從而完成濃縮富集.圖 4為氣溶膠富集器.此方法需結合其他采樣器進行采樣，以提高較低濃度新型冠狀病毒生物氣溶膠的檢出率.

表 1為以上 7種主動采樣法的優缺點分析.單一的采樣方法很難準確地反饋環境中真實的樣本信息，因此多方法聯合采樣可以使采樣結果更加接近真實情況.虛擬濃縮法與沖擊法聯用可以提高低濃度下新型冠狀病毒生物氣溶膠的收集效率[34]，但對于粒徑小于 1μm 的新型冠狀病毒生物氣溶膠粒子，這種方式采樣效率較低.將沖擊法與過濾法聯用，可提高不同環境下新型冠狀病毒生物氣溶膠的采樣穩定性和敏感性，采樣效率較高[35]，因而適合采集醫療操作環境的新型冠狀病毒生物氣溶膠樣品.

圖4 氣溶膠富集器Fig. 4 Aerosol concentrator

表1 主動采樣法的優缺點分析Tab. 1 Advantages and disadvantages of active sampling method

對新型冠狀病毒生物氣溶膠的研究不局限于傳統的采樣-檢測-評估模式，國內外也正在探索一些新方法，其中最具代表性的是基于激光誘導熒光的單粒子檢測法[36-39].該方法通過對光路整形，使新型冠狀病毒生物氣溶膠粒子逐一通過激光檢測區，經激光誘導產生一定波長的熒光信號和散射信號，將所有粒子的熒光信號和散射信號進行聚類分析，可判定其生物屬性和環境濃度.Gabbarini等[40]用發射266nm的紫外激光照射不同病毒，并用光譜儀記錄發射光譜.該分類技術顯示了區分病毒的可能性.此方法不僅可以實時反饋環境中熒光信號和散射信號濃度信息，還能通過機器人搭載進行遠程檢測.但機器感知、算法優化等技術難點尚未完全攻克，因此還處于試驗階段.

2 新型冠狀病毒采樣方法在不同環境下的應用

對不同環境下存在新型冠狀病毒進行差異性采樣可以有效提高采樣效率和采樣精度.準確的采樣數據可以提高新型冠狀病毒的檢測效率，對指導新型冠狀病毒消殺起著至關重要的作用.

新型冠狀病毒感染者接觸過的門把手、水杯等固體表面極易殘留新型冠狀病毒，對于此類固體表面采樣建議采用棉拭子涂抹法.新型冠狀病毒感染者的唾液、尿液和其接觸過的液體環境的采樣可以采取棉拭子涂抹法和滴管采樣法.趙昊寧等[41]在對新型冠狀病毒消毒前進行的物體表面采樣，工作人員先將患者頻繁接觸或多次接觸的物品通過棉拭子置于規格板上采樣，多次連續采樣后，去除工作人員的防護乳膠手套可能觸摸到的部分，在試管中先注入 10mL試驗采樣液，再將樣品存入試管中，及時送檢.

自然沉降法操作簡單，使用成本低，可以被用作現場消殺前新型冠狀病毒采樣.趙昊寧等[41]在對新型冠狀病毒進行現場消毒時，將無菌瓊脂板水平敞開靜置于空氣環境中心處的0.8～1.5m高度，瓊脂板在待消殺環境中水平靜置一段時間，將板蓋蓋好，以保證裝置內部封閉，并在裝置上做標號記錄，及時送檢，此處用到的采樣方法就是自然沉降法.

街道、小區和住宅等人員相對稀疏的地區，其存在新型冠狀病毒的可能性比較小，因此可以采用快速排查方式對其進行檢測分析，如果發現異常，則對異常區域及附近區域進行精確檢測，以便及時切斷傳染源.此類區域可以采用沖擊法和撞擊法進行定點快速采樣，經檢測一旦發現疑似新型冠狀病毒存在，應采用虛擬濃縮法針對性地采樣篩查，排除病毒隱患.

對于超市、地鐵站等人員較為密集的場所，一旦人群中存在新型冠狀病毒感染者，后果將不堪設想.因此，對此類人員相對集中、人員流動性較大的區域，應采取持續采樣的實時監測手段對環境中新型冠狀病毒的存在情況進行準確反饋.氣旋法可以對環境中的新型冠狀病毒進行持續采樣，對應的采樣設備輕巧便攜，適用于移動式動態監控.

對于方艙醫院、隔離留觀病房、隔離病房和隔離重癥監護室等容易產生新型冠狀病毒生物氣溶膠的區域，應考慮其特殊性和重要性，著重采取多方法聯合采樣，以降低采樣誤差和提高采樣效率，減少誤檢誤報情況發生.

以上幾種典型環境下的新型冠狀病毒采樣方法總結見表2.

表2 幾種典型環境的新型冠狀病毒采樣方法Tab. 2 Several SARS-CoV-2 sampling methods for typical environments

3 展 望

新型冠狀病毒具有很強的傳播性和致病性，對其進行高效快速的采樣可以提高病毒檢測效率，并對病毒消殺具有指導意義.常規的病毒采樣方法具有一定的局限性，多方法聯合采樣可以有效增加采樣效率和采樣精度，但同時也會增加采樣成本和采樣難度.新型冠狀病毒的研究不應該局限于“采樣-檢測-消殺”的傳統模式，建議借助現有成熟的生物檢測、數據分析和強大的數據計算單元、數據傳輸技術，開發集采樣、培養、檢測和評價為一體的新型檢測技術與設備.另外，隨著生物檢測技術的發展和大數據產業興起，新的微生物檢測技術將得到發展.例如，通過對空氣中存在的目標病原體進行檢測分析后建立病原基因庫，一旦檢測到相應傳染源，即自動觸發報警，從而實現對環境中目標病原體的實時監測.