微生物農藥液體深層發酵的泡沫產生與控制

劉 芳，廖先清，陳 偉，周榮華，萬中義

（湖北省生物農藥工程研究中心，武漢 430064）

微生物農藥是指微生物本身或（和）代謝產物來防治農作物病、蟲、草、鼠害及促進農作物生長的一類農藥，主要包括細菌農藥、真菌農藥、病毒農藥、微孢蟲及農用抗生素等［1］。液體深層發酵廣泛應用于食品、醫藥及生物化工等行業，具有傳質均勻、易于對發酵參數進行控制及產品質量穩定等特點。一般細菌農藥、農用抗生素及微生物源植物生長調節劑通過液體深層發酵生產，部分真菌農藥也可通過液體深層發酵生產。在所有的微生物農藥深層發酵過程中，由于培養基基質成分、發酵過程中的通氣、攪拌、所采用菌種本身特性等的影響，都會有泡沫的產生，一定數量的泡沫對發酵來說是有利的，可增加液體發酵過程中氣液的接觸，促進氣體交換，從而使氧氣傳遞增加，而發酵過程中產生過多的泡沫則會影響微生物農藥發酵過程中的傳質、溶氧，導致發酵水平降低，或引起逃液，甚至會導致污染，致使發酵失敗、倒罐而產生重大的經濟損失。必須要采用各種方法來控制發酵過程所產生的的泡沫，減少過量泡沫對發酵的不利影響，以保證發酵的穩定性及生產的經濟性。本研究從泡沫的產生原因、形成規律、對發酵的影響及泡沫的控制策略等方面對微生物農藥液體深層發酵過程中的泡沫控制進行總結，以期對微生物農藥深層發酵中的泡沫控制提供借鑒。

1 微生物農藥液體深層發酵過程中泡沫的產生

1.1 微生物農藥液體深層發酵過程中泡沫產生的原因

泡沫是一種氣體在液相中連續分散的體系，氣體被液相的膜分開后形成大小不一的氣泡。一般泡沫中氣體體積占泡沫的體積超過90%［2］。液體深層發酵過程中，泡沫中的氣體主要包括通入的無菌空氣和微生物代謝所產生的氣體。一定數量的泡沫是發酵中的正常現象，有利于發酵過程中氧的傳遞。

發酵過程中泡沫的形成與培養基的組成有關。用于微生物農藥發酵的培養基成分主要包括淀粉、玉米漿、糖蜜、黃豆餅粉、棉子粕、花生餅粉、酵母粉或蛋白胨等。在這些成分中，高蛋白質含量的氮源培養基容易發泡，為主要的發泡因子［3］，1 mg/L 的蛋白質就可以影響到泡沫的形成［4］。由于培養基本身所具有發泡因子，通氣和攪拌會形成泡沫，這種泡沫一般稱為機械性泡沫，通常出現在發酵前期，而且這類泡沫大多在發酵液表面。發酵培養基的滅菌程度也會影響發酵中泡沫的產生，消毒溫度過高或時間過長會使發酵培養基中的糖、氨基酸被破壞，不利于微生物的生長，導致菌體自溶而產生大量的泡沫。

發酵過程泡沫的產生還與通氣、攪拌有關。用于微生物農藥發酵的微生物菌株，大部分為好氧微生物，在其發酵過程中需要向發酵罐中通入大量無菌空氣并進行攪拌，以增大微生物菌體與氧氣的接觸來加速氧的傳遞。由于發酵培養基本身存在發泡性，通氣及攪拌更易導致泡沫的形成。盡管淀粉、糖等培養基成分形成泡沫的能力較差，但是它們會增加培養基的黏度，通氣及攪拌所產生的泡沫會因為培養基的黏度而變得穩定。此外，微生物菌株在發酵過程中由于呼吸作用產生氣體，而這些氣體也會由于攪拌分散到液體培養基中形成穩定的細小泡沫。

此外，泡沫形成及其持久性還與微生物發酵次生代謝產物的表面活性有關。在用于微生物農藥生產的微生物類型中，芽胞桿菌會產生伊枯草菌素、表面活性素及豐原菌素等具有表面活性的脂肽類化合物［5］，而木霉菌產生的Hydrophobin 小分子蛋白質也具有高度表面活性［6］。這些表面活性物質可以降低發酵過程中發酵液的表面張力，并在氣泡的周圍形成穩定的保護膜，從而增強了機械強度，使其不易破裂，致使泡沫的持久性增強。

1.2 微生物農藥液體深層發酵過程中泡沫產生的規律

一般說來，發酵培養基在滅菌時通常會產生大量的泡沫，這種泡沫主要是由于培養基中的起泡性成分所導致，這些泡沫通常在培養基上面，其中氣相所占的比例較大，氣液分界明顯，這種泡沫會由于發酵罐內培養基的升溫、翻動而破裂、減少，甚至是消失。而后，隨著接種及發酵過程中的通氣與攪拌，微生物代謝的加快，大量的起泡質被消耗，導致泡沫減少。隨著微生物生長進入指數生長期，微生物呼吸強度增加，產生氣體，而這種氣體與發酵過程中的通氣混合，并在攪拌的作用下，泡沫會持續增加。后期由于溶氧的下降及菌體的自溶，如果沒有消泡劑的作用，泡沫會進一步增加。不同種類的微生物其生長規律不同，泡沫產生的規律也存在差異，而發酵生產過程中工藝條件的改變也可能會影響泡沫的產生。因此，必須針對不同的微生物農藥弄清其泡沫產生的規律，為后續的泡沫控制提供依據。

2 泡沫對微生物農藥液體深層發酵的影響

液體深層發酵過程中所產生的泡沫對發酵來說通常是有害的，其對發酵產生的不利用影響主要有以下幾個方面：①降低發酵罐的有效發酵體積。發酵過程中通氣及攪拌會導致泡沫的產生，并使得泡沫在發酵中不斷上升，發酵罐中所留的空間不足以容納，泡沫會攜帶發酵液從軸封或排氣管中流出，從而降低實際的發酵液體積，使發酵原料形成不必要的浪費。為了避免發酵過程中泡沫的影響，一些微生物農藥，特別是一些產泡沫較多的芽胞桿菌及假單胞菌，可以選擇較低的裝量，這也使得單罐的生產能力降低。②導致雜菌污染。泡沫引起的逃液會在發酵罐排氣管上殘留一定量的培養基，滋生雜菌，隨著雜菌量的上升，其可能會進入到發酵罐中，導致發酵液受到污染。另外，頂罐的泡沫會侵入軸封，使軸封的密封失效，也可能會導致雜菌的污染。雜菌嚴重污染可能會導致倒罐。③影響發酵過程中的物質傳遞。用于微生物農藥生產的微生物為好氧微生物，其生長需要培養基中有充足的氧。泡沫，特別是持久性泡沫的存在會顯著降低發酵液中氧的傳遞速率，可能會導致發酵液中的溶氧不足。而對于高耗氧的好氧微生物的發酵，低溶氧水平通常會導致菌體的自溶，降低目標產物的產量，最終導致單位罐體積生產能力降低。

3 微生物農藥液體深層發酵過程中泡沫的控制策略

鑒于發酵過程中所產生的持續性泡沫對微生物農藥液體深層發酵的不良影響，必須采取物理或機械方式來破解泡沫，或者采用化學方法改變泡沫液膜的表面張力，打破泡沫液膜，以避免大量持久性的泡沫長期存在。

3.1 物理及機械消泡

在液體深層發酵中，物理消泡主要是通過一些物理方法來消除發酵過程所產生的泡沫，其主要方式包括升溫、降溫、機械聲波、超聲波、液體噴射等［7］。而這些物理消泡方法對發酵過程中的細胞可能有負面影響，而且受到成本及效率的限制，其在微生物農藥液體深層發酵中基本上沒有應用。

機械消泡是通過在發酵罐內或發酵罐外設置特定的裝置，利用機械剪切力和壓力的變化使發酵過程中的泡沫破裂，或者將發酵過程所產生的泡沫排出并回收其中的發酵液來削除泡沫。機械消泡的最大優點是不往發酵罐中添加額外的物質，減少了由于添加化學消泡劑可能帶來的污染問題，但機械消泡方式不能從根本上解決泡沫產生的因素，當泡沫量過大時，機械性消泡裝置不能迅速消除泡沫，需要結合化學消泡劑的使用才能達到消泡的目的［8］。

3.2 化學消泡劑消泡

用于微生物農藥液體深層發酵的消泡劑主要包括天然油脂、脂肪酸、酯類、聚醚類及有機硅類。化學消泡劑通過進入到泡沫的液膜內，并在界面上擴散，改變液膜界面的性能，導致膜的破裂使得泡沫消失［2，9］。不同類型的化學消泡劑抑泡或消泡的原理存在差異，其在發酵過程中添加的方式、添加的量存在較大的差異，需要針對不同的微生物菌株、培養基組成、培養條件、泡沫產生的規律、泡沫的組成與特性來進行篩選。化學消泡劑選擇的原則包括：無毒（對環境無毒、不影響發酵菌株的生長及次生代謝產物的產生）、能夠耐高溫滅菌及對后續的提取工藝無不良影響等。消泡劑可直接添加到發酵培養基中，也可稀釋滅菌后在發酵過程中根據泡沫的產生情況進行流加。

3.2.1 天然油脂消泡劑 用于微生物農藥發酵的天然油脂主要包括豆油、玉米油、菜子油和花生油等。發酵過程中天然油脂的消泡效率隨培養基組成的變化而變化［10，11］。Vidyarthi 等［12］在研究以污泥為基質發酵蘇云金芽孢桿菌時發現，多種植物油，如菜子油、橄欖油及花生油等作為消泡劑對蘇云金芽孢桿菌的生長及其內毒素的產生影響最小，其中菜子油和花生油還可以刺激芽孢的形成和內毒素的產量。一般芽孢桿菌類發酵中添加的植物油的比例較高，可達到發酵體積的0.3%～0.5%。魏浩等［13］篩選了用于Bacillus amyloliquefaciens ES-2 菌株產生抗菌脂肽的消泡劑，發現豆油的消泡效果相對較差，但其作為消泡劑時，B. amyloliquefaciens ES-2 菌株產生抗菌脂肽類化合物的產量明顯高于對照。在某些抗生素的發酵中，前期加入的豆油既可作為消泡劑，也可作為碳源被菌體吸收利用，但在發酵中后期加入的豆油則僅起消泡的作用，而過量的油會使溶氧降低導致菌體代謝異常［14］。天然油脂在存放的過程中易于氧化，添加變質的天然油脂可能會影響微生物的生長，給生產帶來不利影響。

3.2.2 合成化學消泡劑消泡 用于微生物液體深層發酵的化學合成消泡劑主要種類有高碳醇類、聚醚類、有機硅類及聚醚改性硅類［15］，但沒有一種消泡劑可以適用于所有的發酵。在微生物農藥液體深層發酵中，以聚醚類和改性有機硅類，特別是具有不同消泡特性的復配制劑應用較為廣泛。不同類型的微生物農藥，其深層液體發酵過程中泡沫形成原因各不相同，其所需要的消泡劑種類也可能不同。事實上，微生物農藥液體深層發酵所用的消泡劑大多為復配劑，其中有天然油脂、聚醚及有機硅類，以實現發酵過程中的抑泡及消泡。魏浩等［13］篩選了用于B. amyloliquefaciens ES-2 菌株產生抗菌脂肽的消泡劑，發現有機硅的消泡效果和抑泡效果均較好，但是有機硅消泡劑對菌體的生長有輕微的抑制。紀兆林等［16］利用聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚作為消泡劑來發酵產生抗菌蛋白的地衣芽孢桿菌W10，同時比較了其與豆油的消泡效果，采用聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚處理，起泡高峰維持的時間相對較短，而且對于后續的抗菌蛋白的提取無不良影響。

化學消泡劑可能對微生物農藥的發酵有不良影響。植物油可降低溶氧傳質系數約30%［17］，而添加某些有機硅類消泡劑可使氧傳遞速率降低30%～50%［18］。Vidyarthi 等［12］發現，常用的PPG 消泡劑對蘇云金芽孢桿菌利用污泥進行發酵，它對蘇云金芽孢桿菌的生長有害，并降低其發酵的毒力，而另外一種antifoam A 消泡劑可有效控制發酵過程中泡沫的產生，但是對蘇云金芽孢桿菌的生長和毒力有一定的負面作用。海洋芽孢桿菌B-9987 在發酵過程中會產生大量的易起泡物質，需要加入大量的消泡劑，而大量加入消泡劑溶氧水平會大幅度下降，影響菌體的正常生理代謝，使得發酵過程中菌量大幅波動［19］。孫東園等［20］研究了不同類型消泡劑對中生菌素生產的影響，發現多種聚醚類消泡劑明顯干擾中生菌素產生菌的發酵和產素，而有機硅和聚酮-聚醚復合消泡劑基本上沒有影響。有機消泡劑還會影響棘孢木霉分生孢子的產生，盡管豆油對分生孢子的影響最小，但其消泡所需要的時間最長，從10余種消泡劑中篩選了L-101a，其具有很好的消泡和抑泡活性，而且最終分生孢子的產量達到了2.4×108CFU/mL［21］。不同消泡劑對阿維菌素發酵及后處理的影響不同，郭鴻雁等［22］研究發現，加泡敵盡管使阿維菌素的發酵效價有所降低，但板框過濾速度較高，不影響正常生產速度，所加的消泡劑總量也較少，而采用豆油作為消泡劑可以提高發酵的效價，但板框過濾時速率較低，且加量較大，而采用陶瓷膜過濾時，添加豆油時膜通量遞減速率最快。從最終的阿維菌素收率來看，添加加泡敵的收率最高，而添加豆油的收率最低。超濾膜通量降低的主要原因是消泡劑中所添加的乳化劑，如單硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯山梨聚糖硬脂酸鹽等，以及增稠劑，如纖維醚、黃原膠等，它們可能污染超濾膜，形成污垢，從而降低超濾膜的通量［23］。

3.3 其他消泡方法

在液體深層發酵時，提高發酵罐反壓、降低攪拌轉速或減少通氣可以減少泡沫，這也是在微生物農藥液體深層發酵經常采用的方法。這3 種方法都會影響微生物的生長及其有效成分的產生，從而影響微生物農藥的發酵效率，增加生產成本［24］。 Lee等［25］發現化學合成的消泡劑不能控制Bacillus sp.GB16 所產生的大量泡沫，而且還會抑制該菌株產生脂肽類化合物。利用植物油和硬脂酸鹽作為消泡劑，通過流加過氧化氫，顯著抑制了泡沫的產生，并大大提高了脂肽化合物的產量。通過菌種誘變來提升生產菌株對消泡劑的耐受力是工業菌種選育中一個重要方法。韓娜［26］采用化學誘變，利用含4% 消泡劑的培養基篩選耐消泡劑的阿維菌素高產菌株，從中獲得了耐受4% 消泡劑的突變株，其產量較對照菌株提高14.3%～17.3%。孫東園等［20］研究發現，通過紫外誘變得到的中生菌素突變株uv-69 對各種消泡劑具有較好的耐受力。通過誘變獲得對消泡劑耐受能力提升的突變株，可減少添加正常劑量的消泡劑對微生物菌株生長及產素的影響。

4 小結

大多數微生物液體深層發酵過程中都有泡沫的產生，而泡沫的產生與培養基組成、pH、滅菌過程、微生物的特性及生產工藝條件等密切相關。過多的泡沫會對微生物農藥的發酵產生不利影響，包括影響發酵的效率、導致污染、影響菌體的生長及次生代謝等。要降低泡沫對微生物農藥液體深層發酵的不利影響，必須根據不同的微生物農藥所用的菌種的生長特性、發酵培養基組成、發酵及后處理生產工藝、泡沫產生的規律及其特性等篩選合適的消沫方法和適當的消泡劑。