結直腸癌中錯配修復基因與Ang-1/2表達的相關性研究

張東晴 薛昊罡 張曉波 李 攀 姜 晶 張雪燕 吳思蒙 任立群 張繼紅▲

1.北華大學，吉林吉林 132013；2.北華大學附屬醫院骨外科，吉林吉林 132011；3.北華大學附屬醫院病理科，吉林吉林 132011；4.吉林大學藥學院實驗藥理與毒理學教研室，吉林長春 130021

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是生命歷程中的殺手之一。CRC的癌變過程涉及多個因素，如吸煙[1]、酒精攝入[1]、乳糜瀉[2]、環境及遺傳因素等。目前的研究進展中得知，在CRC的發病機制及相關因素中，最受關注的是染色體不穩定和錯配修復基因缺陷兩大主要因素。在CRC中，錯配修復基因完整型病患在臨床治療效果和術后生活質量方面都差于缺陷型病患[3]，并且在臨床診治過程中，缺陷型患者在療效方面體現了更多的優勢和效果[4]。在CRC中，血管生成是評估預后和治療靶點，同時血管的形成對于治療效果和術后改善情況有評估價值[5]。血管生成素 -1（Angiopoietin-1，Ang-1）、血管生成素-2（Angiopoietin-2，Ang-2）是研究的熱點。在肺癌[6]、肝癌[7]中Ang-1與疾病的進展及預后密切相關。在腦膜瘤[8]中Ang-2是評估疾病預后的監測指標。Hong等[9]提出CRC中Ang-2與淋巴結轉移及患者臨床轉歸有關，生存期較差。錯配修復（Mismatch repair，MMR）基因和血管生成素（Angiopoietin，Ang）均與CRC的發生發展存在相關性，而兩者之間是否存在相關性的研究很少，本實驗運用Envision法（多聚體兩步法）檢測 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、Ang-1和 Ang-2蛋白表達，并研究前四者與Ang-1、Ang-2的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般材料

收集2015年1月～2018年12月北華大學附屬醫院病理科確診的結直腸癌石蠟標本96例，男41例，女55例，年齡40～88歲；直腸61例，右半結腸22例，左半結腸13例；高分化19例，中分化73例，低分化4例；淋巴結轉移31例，無轉移65例；腺癌-NOS 82例，腺瘤樣腺癌1例，黏液腺癌13例；潰瘍型63例，隆起型33例。

1.2 試劑與方法

主要試劑：鼠單抗MLH1（生產批號：19041822）、MSH2（生產批號：19092007）、MSH6（生產批號：19101812）和 PMS2（生產批號：19082104），DAB試劑盒（生產批號：2020F0119），以上試劑均購于北京中杉金橋生物工程公司；鼠多抗Ang-1（生產批號：ZP6987BP87）和 Ang-2（生產批號：326498），購于武漢博士德生物工程。

所有標本：10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后以4μm厚度連續切片，烤箱脫蠟，利用羅氏診斷公司BenchMark GT全自動多功能組織病理檢測系統，采用Envision法（多聚體兩步法），一抗分別加入MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、Ang-1和 Ang-2，配合ultraView DAB檢測試劑盒顯色，依次梯度酒精、二甲苯透明、封片，染色結果由兩名高級職稱病理醫師進行雙盲判讀。

1.3 結果判定

含有棕黃色或棕褐色的腫瘤細胞為陽性結果。在低倍鏡下選定區域，再使用高倍鏡從中選定5個陽性結果集中的視野，對陽性結果均采用半定量評分。Ang-1、Ang-2漿表達，MLH1、MSH2、MSH6和PMS2核表達，著色強度如下：0分為不著色，1分為淡黃色；2分為棕色；3分為棕褐色。按陽性細胞率：（1）Ang-1、Ang-2：≤5%為0分；6%～25%為 1分；26%～50%為2分；≥ 51%為3分，兩結果乘積，≤ 1分為 -，2分為 +，3～4分為++，5～6分為 +++，≥ 2分為陽性，＜ 2分為陰性。（2）MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2：＜ 1% 為 0分；1%～10% 為 1分；11%～50% 為 2分；51%～80%為3分；＞80%為4分，兩結果乘積≥2分為陽性，＜2分為陰性[10]。

1.4 統計學方法

采用SPSS20.0統計學軟件分析數據，計數資料用頻數和百分比表示，利用χ2檢驗、Fisher確切概率法和Spearman相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ang-1、MSH2在結直腸癌中的表達特征

96例已確診結直腸癌石蠟標本，經免疫組化法染色。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均細胞核染色為陽性，Ang-1、Ang-2均細胞漿染色為陽性。Ang-1染色結果陽性見圖1A、陰性見圖1B，MSH2染色結果陽性見圖1C、陰性見圖1D。

圖1 免疫組化染色結果圖示（×400）

2.2 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2表達情況及相關性分析

96例CRC中MLH1不表達為11例，概率最大；MSH2、MSH6不表達均為2例，概率最小；4例MLH1與PMS2共同不表達，2例MSH2、MSH6共同不表達。Spearman相關性分析，MLH1與PMS2之間、MSH2與MSH6之間表達呈正相關（r＞0，P＜ 0.05），見表 1。

2.3 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2表達與臨床病理的關系

MLH1和PMS2在右半結腸癌和低分化結直腸癌中不表達的概率更大，在性別、年齡、淋巴結轉移、大體及組織學類型方面無統計學意義（P＞0.05）；MLH1和PMS2的缺失表達在部位、分化程度方面有顯著相關性（P＜0.05）。MSH2、MSH6的缺失表達與患者的性別、年齡、部位、分化程度、淋巴結轉移、大體類型、織學類型均無相關性（P＞0.05），見表2。

2.4 Ang-1、Ang-2表達與臨床病理各因素的關系及相關性分析

在有淋巴結轉移情況下Ang-1低表達，Ang-2高表達，Ang-1與Ang-2均與淋巴結轉移有相關性（P＜0.05），而在本研究的其他因素方面均無相關性（P＞ 0.05），見表 3。

表1 錯配修復蛋白在結直腸癌在表達的相關性

2.5 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、Ang-1、Ang-2表達及相關性分析

Ang-1與Ang-2蛋白表達率：Ang-1（-）、達與Ang-1、Ang-2表達之間無相關（P＞0.05），見表4。Ang-1（++）均 為 最 高 33.33%，Ang-1（+）為25.00%，Ang-1（+++）為 8.34%；Ang-2（-）為最高46.87%，Ang-2（+）為 41.67%，Ang-2（++）為11.46%，Ang-2（+++）為0。Spearman相關性分析結果顯示，MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的缺失表

表2 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2表達與臨床病理各因素的關系（n=96）

表3 Ang-1、Ang-2表達與臨床病理各因素的關系（n=96）

3 討論

CRC是危害人類生命健康的惡性疾病，在男性和女性腫瘤患者中分別位居第三、第二的地位[11]，使患者的生活質量降低和壽命縮短，早診斷、早治療對于改善預后有著不可低估的價值。分子檢測在臨床診治過程中不僅從分子層面提高對疾病發生和發展的認知，也在診療方向帶來了新的啟發點。免疫治療成為了癌癥不可忽視的治療手段[12-13]。MMR系統由一系列特異的DNA錯配修復酶組成，通常依賴于4個關鍵基因，即mutL同源1（MLH1）、減數分裂后分離增加 2（PMS2）、mutS 同源 2（MSH2）和 mutS 同源 6（MSH6）[14]。

Ang-1、Ang-2對維持腫瘤血管狀態有重要作用[15]。血管生成不僅是腫瘤演變過程的基本因素，也是臨床治療的有效靶點[16]。健康人群中，Ang水平保持相對穩定，而在癌癥患者的血清中Ang水平顯著升高，尤其是CRC、急性髓系白血病（Acute myeloid leukaemia，AML）、多發性 骨 髓瘤（Multip myeloma，MM）和骨髓增生異常綜合征（Myelodyspalastic syndromes，MDS），是 CRC 潛在的腫瘤標志物[17]。

本實驗檢測了96例結直腸癌患者的四種MMR 基因（MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2）和Ang-1、Ang-2蛋白的表達情況。結果顯示，MMR基因總缺失率為14.58%（14/96），與目前文獻[18]報道的15%～20%相符合。由本研究結果分析，部分病例出現MLH1與PMS2、MSH2與MSH6表達均呈一致性的特點，與文獻[19]中報道的錯配修復基因之間蛋白質復合物（二聚體MLH1/PMS2和MSH2/MSH6）形成的觀點相印證。MLH1、PMS2在發病部位存在相關性（P＜0.05），在右半結腸的CRC中蛋白表達缺失率最高。MLH1、PMS2在分化程度方面均存在相關性（P＜0.05），分化程度越低，則CRC中蛋白表達缺失率越高。本實驗還發現，MLH1、MSH2、MSH6三者都表達，唯獨缺少PMS2病例，這可能與目前文獻[20]中提及的PMS2自身原因導致的遺傳物質不穩定相關。本研究結果顯示，淋巴結轉移與Ang-1、Ang-2的表達存在一定的關聯，Hong等[9]在關于Ang-2的研究中也提及此觀點。本結果中Ang-2在淋巴結轉移時表達率高，提示Ang-2促進了CRC的淋巴結轉移，影響其預后，Peterson等[21-22]學者也支持Ang-2影響腫瘤預后的觀點。Jary等[23]報道Ang-2不僅在癌癥演變過程中促血管生成，也影響了轉移。Fagiani等[24]研究認為，Ang-1與Ang-2在維持血管狀態方面的作用是相對的，Ang-1保持血管狀態平穩，而Ang-2則通過破壞這種狀態在血管方面發揮作用，同時Parikh等[25]提出Ang-2在血管的萌生和塑形過程中存在影響，這可能是Ang-1、Ang-2在不同淋巴結轉移狀態表達率不同的原因引起。本研究結果還顯示，MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2的缺失與Ang-1、Ang-2表達無相關性，推測可能是MLH1、MSH2、MSH6、PMS2缺失表達與 Ang-1、Ang-2表達無明確關系，Jary等[23]研究也提出Ang-2表達在錯配修復基因正常型與缺陷型結直腸癌中無明顯差異。

綜上所述，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2缺失與Ang-1、Ang-2表達無相關性。本實驗研究具有真實性，能夠為今后的研究提供可靠的理論依據，但由于條件因素的影響，實驗樣本取材較少，今后仍需要大量樣本進行下一步研究和探討。