痰液保存條件對恒溫擴增熒光法核酸檢測結果的影響

佘 軍 高迎春 來漢江 王 賢 饒煥新 賀君麗 孫 剛 周艷瓊▲

1.杭州市蕭山區第一人民醫院臨床微生物科，浙江杭州 311200；2.杭州優思達生物技術有限公司，浙江杭州 310053

結核病是由結核分枝桿菌引起的傳染性疾病，以肺部感染最為常見，是僅次于艾滋病所引發的第二大致死傳染病，嚴重威脅人類健康[1]。據世界衛生組織（WHO）2019年全球結核病報告，2018年約有1000萬結核新發病例。WHO將結核病作為重點控制的傳染病之一。我國高度重視肺結核的預防和控制。為進一步提高結核病的病原學診斷率，“十三五”全國結核病防治規劃要求，我國東中部地區和西部地區分別有80%和70%的縣（市、區）應具備開展結核病分子生物學診斷的能力[2]。而痰液的病原學檢查，如涂片鏡檢、痰液培養、核酸檢測等方法，是輔助結核病診斷的重要手段[3]。考慮到許多區縣級實驗室的人力資源有限，樣本量較少，可能采取連續幾天存樣，再集中檢測的工作模式。根據國衛辦疾控函〔2016〕672號和中疾控疾控便函〔2017〕80號通知，我國對結核病試行分級診療模式，痰液樣本或需要運送至上級醫院（如地市級、省級醫院或疾病控制中心）進行菌種鑒定、藥敏試驗等檢驗。在痰結核分枝桿菌檢驗過程中，對陽性率的影響因素眾多，如痰液采集方法、時機、痰液性狀及質量、轉運等[4-14]。如何保證樣本在儲存或運輸后不會影響后續分子診斷結果，成為迫切需要研究的問題。

本研究旨在探討痰樣本保存條件和保存時間對痰液樣本中核酸檢測結果的影響。尋找妥善的痰液保存方式以保證核酸檢測結果的準確性，為基層實驗室分子生物學診斷工作的開展提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 樣本來源

痰液樣本來自杭州市蕭山區第一人民醫院臨床微生物科室在2018年11月～2019年1月日常檢驗的剩余樣本104例。

1.2 樣本篩選

選取痰液樣本體積不少于1.5mL。

1.3 樣本分裝

將每份痰液分別分裝為2～3等份，每份0.5mL，保存于2mL凍存管中。

1.4 保存條件及檢測組別設置

（1）室溫穩定性試驗。將痰液樣本和溫度記錄儀（深圳市華圖測控系統有限公司）存放于室溫環境下，以試驗開始記為第0天。分別在第0天、第5天和第8天，記錄痰液核酸的檢測結果。（2）冷藏穩定性試驗。將痰液樣本和溫濕度記錄儀一起存放于冰箱冷藏室內，以試驗開始記為第0天。分別在第0天、第5天和第8天，記錄痰液的核檢測結果。（3）冷凍穩定性試驗。將痰液樣本和溫濕度記錄儀存放于冰箱冷凍室內，以試驗開始當天記為第0天。分別于第0天、第1個月和第3個月，對痰液進行核酸檢測，記錄檢測結果。（4）凍融穩定性試驗。將痰液樣本存放于冰箱冷凍室內，以試驗開始當天記為第0天。從第1天起，每天將痰液樣本從冰箱中取出，解凍1h至室溫后，再放回冰箱冷凍。分別于第0天和第4次凍融后，對痰液進行核酸檢測，記錄檢測結果。

1.5 核酸檢測

依據《結核病實驗室檢驗規程》進行痰液樣本的液化處理[4]。使用結核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑盒（恒溫擴增-實時熒光法）（MTC2.0試劑盒，國械注準20193401027）以及配套的全自動醫用恒溫擴增熒光分析儀（杭州優思達生物技術有限公司），按照產品說明書進行痰液樣本的核酸檢測。記錄檢測結果（陰性或陽性）和擴增曲線的Tt值。

1.6 統計學處理

采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析，計數資料以[n（%）]表示。對比同一保存條件下不同時間點的Tt值差異采用單因素ANOVA分析。兩組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 室溫穩定性試驗

本研究記錄的室溫范圍為14～22℃。對室溫（14～22℃）存放5d和8d的痰液樣本進行核酸檢測，檢測結果見圖1，室溫第0天檢測結果為8例陽性、18例陰性。室溫存放第5天和第8天后再次檢測，均與室溫0d檢測結果一致，未發生陽性樣本漏檢的情況。見表1。

表1 室溫放置不同時間對痰液樣本檢出率的影響

樣本在室溫存放第0天、第5天和第8天，擴增速率比較，差異無統計學意義（P=0.425）。見圖1，表2。

圖1 室溫存放樣本對核酸檢測速率的影響

2.2 冷藏穩定性試驗

本研究記錄的冷藏溫度為4～8℃。如表3所示，0d檢測結果為11例陽性、15例陰性。冷藏5d和8d后再次檢測，均為11例陽性和15例陰性，與0d檢測結果一致，未發生陽性樣本漏檢的現象。

表2 室溫放置不同時間對樣本擴增速率的影響（±s）

表2 室溫放置不同時間對樣本擴增速率的影響（±s）

時間 n 樣本擴增速率 F P室溫第0天 8 16.24±4.50 0.891 0.425室溫第5天 8 16.28±5.80室溫第8天 8 20.03±8.58

表3 冷藏條件下放置不同時間對痰液樣本檢出率的影響

但是，MTC2.0試劑盒的核酸擴增速率（Tt值）同樣出現逐漸變大的現象（圖2）。樣本在冷藏條件下存放第0、5和8天，擴增速率比較，差異無統計學意義（P=0.066）。見表4。

圖2 冷藏保存樣本對核酸檢出速率的影響

表4 冷藏保存樣本不同時長對擴增速率的影響（±s）

表4 冷藏保存樣本不同時長對擴增速率的影響（±s）

時間 n 樣本擴增速率 F P冷藏第0天 11 11.08±4.01 2.973 0.066冷藏第5天 11 12.19±4.61冷藏第8天 11 15.10±3.26

2.3 冷凍穩定性試驗

本研究記錄的冷凍溫度在-18～-23℃之間循環變化。對冷凍第1個月和第3個月的痰液樣本進行再次檢驗，如表5所示，結果與冷凍0d檢測結果一致，樣本均為9例陽性、17例陰性，未發生錯檢現象。

表5 冷凍條件下放置不同時間對痰液樣本檢出率的影響

通過分析陽性樣本的擴增速率（Tt值）可見，與對照組冷凍0d的擴增Tt值相比，痰液樣本冷凍第1個月和冷凍第3個月后，擴增曲線的Tt值已顯著延緩（圖3），差異有統計學意義（P＜0.05），見表6。

圖3 冷凍保存樣本對核酸檢測速率的影響

表6 冷凍存放樣本不同時長對擴增速率的影響（±s）

表6 冷凍存放樣本不同時長對擴增速率的影響（±s）

時間 n 樣本擴增速率 F P冷凍第0天 9 10.50±2.01 4.895 0.016冷凍第1個月 9 13.20±2.57冷凍第3個月 9 17.47±7.57

2.4 凍融穩定性試驗

按照實驗方法，將樣本進行反復凍融4次，其檢測結果與凍融0次的一致，9例陽性、17例陰性，見表7，未發現錯檢現象。

表7 凍融次數對痰液樣本核酸檢出率的影響

分析Tt值可知，凍融4次后，痰液樣本核酸檢測速率與凍融第0次無顯著延遲（圖4），差異無統計學意義（P=0.986）。見表8。

圖4 凍融樣本對核酸檢測速率的影響

表8 凍融次數對擴增速率的影響（±s）

表8 凍融次數對擴增速率的影響（±s）

次數 n 樣本擴增速率 t P凍融第0次 9 13.67±5.11 0.018 0.986凍融第4次 9 13.68±5.59

3 討論

有研究表明痰液保存條件對病原學檢查結果有影響，痰液長期存儲后會導致培養陽性率下降[10-14]。本研究從分子診斷的核酸檢測的角度探討了痰液樣本在保存過程中核酸檢測結果的變化，得到了與此前研究類似的結果。盡管未發現錯檢、漏檢樣本的現象，但核酸擴增速率（Tt值）的延遲，充分說明了痰液核酸在不利條件下的保存過程中發生了降解。

盡管常溫存放5～8d，樣本核酸擴增速率無統計學差異。但觀察8例陽性樣本的熒光擴增速率，隨著室溫存放時間的延長，擴增Tt值逐漸變大，即擴增變慢的趨勢，甚至有1例樣本出現漏檢的風險（圖1）。而此前的研究顯示，痰液樣本存放需要14～28d，其培養陽性率才會顯著下降。這種差異的出現，可能原因有：（1）核酸擴增試劑具有較高靈敏度，這使其能夠在更早的時間內發現痰液核酸的微量變化。（2）本研究已經發現隨著存放時間延長，核酸擴增速率變慢，若繼續延長本研究的試驗周期，核酸降解進一步加劇，很可能也會出現漏檢結果。因此，本研究與之前的研究結果本質上仍然是一致的，均表明痰液樣本不可存放過久。

冷藏保存研究的樣本中出現1例（圖2箭頭指示）在冷藏5d后核酸擴增速率顯著延遲，而在冷藏8d后其擴增速率變快而無顯著延遲的現象，考慮是對該樣本進行分組時，取樣不均所致。統計分析結果顯示，樣本冷藏保存0、5和8d的擴增速率差異不顯著。

本研究中室溫保存（14～22℃）5d與冷藏保存（4～8℃）5d，都未發現痰液核酸有顯著降解。其原因可能是，這兩種保存溫度都遠低于大多數生物活性物質的最佳溫度37℃。鑒于氣溫的晝夜變化和季節性波動，室溫條件實在難以避免痰液中雜菌生長和核酸降解的加速，進而影響后續結果的準確性。因此，對比上述兩種保存條件，本研究建議優先選擇冷藏保存痰液的方式。

此前有研究提示樣本反復凍融可使痰液中的微量菌種發生改變，從而影響核酸檢測結果[15]，但本研究中并未發現反復凍融對結核菌核酸檢測結果的影響。此差異的可能原因有：一方面，可能是因為結核菌陽性患者的痰液中，結核菌載量較大，反復凍融造成的影響不顯著。另一方面，此前研究發現只有在反復凍融3次以上后，痰液中的微量菌種才會開始發生改變，而本研究中只做到了4次凍融測試，受凍融次數和樣本量的限制，本研究尚未觀察到凍融對核酸檢測結果有顯著影響。但對于大多數檢驗實驗，反復凍融4次已足夠滿足日常工作的需要。

值得注意的是，核酸檢測試劑無法鑒定結核菌活性。即使結核菌的生長活性受到樣本存放條件的影響，但只要基因組核酸沒有降解，核酸檢測的結果就不會改變。因此，本研究的結果不適用于樣本保存后的培養檢驗。

綜上所述，本研究從結核檢驗實驗室的實際工作需求出發，探討了不同保存條件對結核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑盒（恒溫擴增-實時熒光法）的痰液樣本核酸檢測結果的影響。在條件允許的情況下，痰液樣本應盡量做到當天檢測，以獲得最準確的檢測結果。如當天無法檢測，痰液樣本應保存在冷凍環境下，時間不超過1個月并避免反復凍融，或保存在冷藏條件下，時間不超過5d，以確保后續核酸檢驗結果的可靠性。