335例早期自然流產患者胚胎絨毛染色體分析

袁思敏，徐 霞，廖 燦，李 茹，張永玲，梁 錚

(1.廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心產前診斷中心，廣東 廣州 510623；2.廣州醫科大學金域檢驗學院，廣東 廣州 510182；3.廣州中醫藥大學附屬第二臨床醫學院，廣東 廣州 510120)

自然流產是婦科的常見病之一，發生率約為15%。其中早期自然流產占全部自然流產的80%[1]。自然流產的病因復雜，機制尚不明確。據統計，50%～60%的早期自然流產是由于胚胎染色體異常所致[2]。目前國內臨床上主要運用傳統細胞遺傳學方法對流產胚胎的絨毛組織進行染色體核型分析，從而反映胚胎的染色體情況。隨著分子遺傳學技術的發展，熒光定量聚合酶鏈反應技術(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，QF-PCR)及染色體微陣列分析技術(chromosomal microarray analysis，CMA)相繼出現。QF-PCR的優點在于能快速檢測染色體的非整倍體異常，CMA技術則能檢測出染色體亞顯微結構的變異。本文回顧分析了廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心335例早期自然流產患者的胚胎絨毛QF-PCR及CMA檢測結果，并探討不同年齡孕婦和不同胚胎性別發生胚胎染色體核型異常的差異。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月1日至2017年1月31日在廣州醫科大學附屬婦女兒童醫療中心就診的經B超檢查發現胚胎停止發育，明確診斷為自然流產的335例孕婦。孕婦年齡為22～44周歲，年齡中位數為31歲；孕周為6～12周；既往無或曾發生≥1次無顯誘因自然流產；本次妊娠抗磷脂抗體、抗核抗體、抗甲狀腺微?？贵w等各種自身抗體陰性，并且血清IgA水平正常。排除患有泌尿生殖系統感染或活動性炎癥及內外生殖系統解剖異?；蚱髻|性病變的病例。研究對象均了解本研究內容并同意配合檢測工作，簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

收集研究對象的流產物組織及該孕婦的外周血樣本，提取人類基因組DNA(gDNA)。根據QF-PCR標準試驗操作流程對所有樣本的gDNA進行檢測，鑒定流產胚胎的絨毛組織有無母體組織污染，并初步檢測流產胚胎絨毛樣本是否為13-三體、18-三體、21-三體或性染色體X單體。根據美國Affymetrix公司的CytoScan 750芯片平臺的標準實驗操作流程對合格的gDNA樣本進行檢測，并使用相配套的CHAS軟件對掃描芯片產生的.CEL文件進行數據分析。把分析出的拷貝數變異(copy number variations，CNVs)與DGV(含正常人的CNVs)、DECIPHER(含患者的表型及致病性片段)、OMIM(含已知的致病基因)、CAGdb、ISCA(含良性與致病性的CNVs)、UCSC Genome Browser(顯示片段中基因的內容及功能)及PubMed等數據庫及本實驗室的內部數據庫進行比對，判斷檢測出的CNVs的性質。根據CMA結果將流產孕婦分為未見異常組、染色體數目異常組、致病性微缺失/重復組(致病性CNVs組)、不明確微缺失/重復組(variants of unknown significance，VOUS)。分別比較各組間孕婦年齡及胚胎性別差異，并統計分析異常核型的種類及檢出率。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計數資料采用例數(n)和百分數(%)進行描述，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流產胚胎絨毛QF-PCR檢測結果

在對335例自然流產患者的絨毛組織進行CMA檢測中，取材不合格30例；提取gDNA后，經過瓊脂糖電泳發現DNA降解有3例。共302例進行了QF-PCR檢測，其中，QF-PCR鑒定存在母體污染的有7例，剩余295例。在295例患者胚胎絨毛組織中QF-PCR檢出異常結果共76例，異常率為25.76%。QF-PCR檢測結果異常類型見表1。

表1 QF-PCR檢測結果異常類型Table 1 Abnormal types of QF-PCR detection results

2.2 流產胚胎絨毛CMA檢測結果

2.2.1異常率

經QF-PCR鑒定gDNA后，實際進行CMA檢測的有295例，檢測成功率為100%。在檢測成功的295例患者胚胎絨毛組織中，CMA結果未見異常CNVs的有96例，占32.54%。異常和/或存在不明確片段的有199例，占67.46%。

2.2.2染色體異常類型

在CMA檢測出異常和/或存在不明確片段的199例中，染色體數目異常共165例，占總異常的82.91%，以非整倍體異常為主，尤以性染色體單體及16-三體多見。染色體數目異常分布見圖1。CMA在13-三體、18-三體、21-三體、X單體及三倍體的檢測結果，與QF-PCR檢測結果一致。染色體數目異常類型見表2。

表2 CMA檢測染色體數目異常核型類型及例數Table 2 The types and cases of abnormal chromosome number detected by CMA

除單純染色體數目異常外，本研究發現24個致病性CNVs，涉及16例孕婦，其中2例合并三體，見表3。主要分布在3、5、20、22、X染色體上，見圖1，但未見相同的CNVs重復出現。臨床致病性CNVs均涉及已知致病基因，在OMIM、ISCA、DECIPHER和PUBMED數據上均有與該CNV相似區域拷貝數變異的病例報道，相關臨床表現為發育遲緩、骨骼發育異常、智力低下等。體格或精神方面的發育遲緩在兒童或成人中具有明顯的臨床表征，而在胚胎時期則可能表現為胚胎停育、胎兒生長受限以致流產。因此，這些區域所涉及的CNV考慮與早期自然流產有臨床相關性，診斷為致病性CNVs。這些CNVs長度在0.301～46.870Mb之間，見表3。片段大小在5Mb以下的占58.33%(14/24)，通過比對OMIM、ISCA、DECIPHER和PubMed數據，診斷微缺失/微重復綜合征4例。片段大小在5Mb以上的占41.67%(10/24)，其中2例診斷為貓叫綜合征。

圖1 CMA檢出染色體異常類型分布圖Fig.1 Distribution of chromosomal abnormalities detected by CMA

表3 CMA檢測致病性CNVs類型Table 3 Pathogenic CNVs detected by CMA test

本研究檢出VOUS 62個，見表4。其片段長度在0.204～60.640Mb之間。涉及病例51例，僅存在VOUS的有18例。這些片段不存在于上述所檢索的數據庫中。其中6個CNVs(見表4的56～61號CNVs)未包含已知基因,臨床考慮為可能良性CNVs；1個CNVs(見表4的62號CNVs)包含了DECIPHER數據庫中患者編號：248531，攜帶的大小分別為370kb(chr10:226 083～596 534)和53kb(chr10:226 083～2 798 911)兩個片段。臨床表型分別包含了自閉癥、關節松弛、智力障礙、語言發育遲緩、小頭畸形、癲癇等，因此考慮該CNVs可能致病。同時，本研究檢出VOUS主要集中在4、5、6、10和22號染色體上，見圖1。

表4 CMA檢測意義不明確CNV類型Table 4 CNV type of variants of unknown significance detected by CMA

序號異常片段片段大小(Mb)31arr19q13.43(56920294～57370445)×30.45032arr2p15(61585880～61834624)×10.24933arr4q21.1(77803210～78182325)×30.37934arr12q22(93239925～93800927)×40.56135arr14q12(30761737～31377083)×30.61536arr17p13.3(525～585504)×30.58537arr8q24.21(128239298～128738481)×30.49938arr14q24.2(70843923～71169474)×30.32639arr4q21.1(77472643～77749161)×30.27740arr19q11q12(28271417～29214176)×30.94341arr13q12.11(20699294～20966903)×30.26842arr5q31.1(134640507～135076022)×30.43643arr8q23.1(108152832～109622398)×11.47044arr9q22.33(101339710～101678356)×30.33945arr22q13.31q13.33(48145833～50788194)×32.64046arr5p15.1(16832107～17862130)×31.03047arr19p13.3(5098335～6289297)×31.19048arr7p15.1p14.3(28618377～28838420)×30.22049arr10p14(6775897～7319819)×30.54450arr10p12.31(20880386～21139316)×30.25951arr17p13.3(525～1008154)×11.01052arr4q12q13.1q21.21(57126377～82092870)×2hmz24.97053arr4q28.3q34.1(132521696～173629849)×2hmz41.11054arr6p22.1(29458476～29777844)×30.31955arr4q27(122176769～122462118)×10.28556*arr2p22.3(34099791～34361545)×10.26257*arr13q21.1(58630720～59112251)×10.48258*arr8p23.3(1220580～1435705)×30.20459*arr16q23.3(82735122～82939477)×30.34660*arr22q12.1(27753449～28111806)×30.35861*arr9q33.1(121027204～121444084)×10.41762﹟arr10p15.3(184165～628967)×30.445

2.3 孕婦年齡與CMA結果的關系

根據CMA結果將流產孕婦分為未見異常組(96例)、染色體數目異常組(165例)、致病性CNVs組(16例)、VOUS組(18例)。本研究中自然流產孕婦的年齡中位數是31歲(22～44歲)。其中，染色體數目異常組孕婦年齡中位數是32歲(22～44歲)；致病性CNVs組孕婦年齡中位數是29歲(23～38歲)；VOUS組孕婦年齡中位數是30歲(25～36歲)；未見異常組孕婦年齡中位數是31歲(23～40歲)。染色體數目異常組孕婦與未見異常組孕婦年齡比較差異有統計學意義(Z=-2.638，P<0.05)。

根據孕婦年齡進一步分為5個年齡段：<25歲、25～29歲、30～34歲、35～39歲、≥40歲。<25歲、25～29歲、30～34歲孕婦流產胚胎絨毛染色體數目異常的發生率波動在50.00%左右；35～39歲組、≥40歲孕婦染色體數目異常的發生率明顯升高。25歲以后，隨著孕婦年齡的增高，染色體數目異常發生率增高，VOUS發生率降低，而致病性CNVs的發生率波動在5.00%左右。40歲以上孕婦流產胚胎絨毛CMA未檢出致病性CNVs及VOUS，見表5。

表5 不同年齡段孕婦流產胚胎絨毛CMA結果[n(%)]Table 5 CMA results of aborted embryo villi in pregnant women of different ages [n(%)]

2.4 胎兒性別與CMA結果的關系

CMA檢測出男性胚胎149例，女性胚胎146例。男女胚胎比例為1.02∶1。在未見異常組中，男性胚胎占57.29%，高于女性胚胎占比(42.71%)。VOUS組中，男性胚胎占77.78%，明顯高于女性胚胎(22.22%)。然而，在染色體數目異常組中，男性胚胎(43.64%)少于女性胚胎(56.36%)。染色體數目異常組與未見異常組、VOUS組胚胎性別比例差異均有統計學意義(χ2值分別為4.53、7.60，均P<0.05)，見表6。

表6 不同類型流產胚胎絨毛CMA結果胎兒性別分布[n(%)]Table 6 The gender distribution of fetuses with different abortive embryo villi CMA results[n(%)]

3 討論

3.1 應用QF-PCR技術結合CMA技術對流產胚胎絨毛染色體進行檢測有優越性

3.1.1本研究方法能有效提高流產胚胎絨毛染色體檢測的成功率及準確率，縮短檢測時間

目前，對流產胚胎絨毛染色體核型分析普遍使用傳統的細胞遺傳學方法，需要對絨毛細胞進行培養，對標本的取材及技術人員的要求比較高。據報道應用傳統細胞遺傳學方法對流產胚胎絨毛染色體進行分析，細胞培養成功率在58.62%～98.30%之間[3-8]。而且檢測分辨率低，只能檢測到5～10Mb以上的染色體異常。CMA技術及QF-PCR技術是從分子水平檢測體細胞染色體的分析技術，無需進行細胞培養，通過檢測樣本的gDNA，分析樣本染色體。QF-PCR技術具有檢測快速、成本低、操作容易等優點。CMA技術在染色體檢測上具有高通量的優勢，能一次性檢測并分析整個基因組的拷貝數，檢測準確率高。本研究中，CMA檢測成功率為100%。除染色體數目異常外，本研究檢測出片段在0.301～46.870Mb的致病性CNVs，明確診斷4例微缺失/微重復綜合征及2例診斷為貓叫綜合征。并檢測出片段在0.204～60.642Mb之間的不明確CNVs。

3.1.2本研究方法能有效避免傳統細胞遺傳學檢測方法中母體組織污染問題

傳統細胞遺傳學方法由于無法鑒別貼壁生長的細胞是絨毛組織細胞還是母體的脫膜細胞，故不能排除因混入母體組織造成結果誤判風險。本研究方法通過QF-PCR技術能對樣本否存在母體組織的污染進行檢測。本研究通過QF-PCR技術，排除了7例存在母體組織污染的標本。

3.1.3本研究方法分辨率高，能提高流產胚胎絨毛染色體異常檢出率

CMA技術檢測分辨率高，精確定位變異區段的位置[9-10]，而且，其檢測的范圍更廣，能夠鑒別雜合性缺失(LOH)、單親二倍體(UPD)，以及遺傳一致性區域(IBD)[11]。本研究總異常率為67.46%，明顯高于本實驗室使用傳統細胞遺傳學技術檢測流產胚胎絨毛染色體核型的異常率[11]。

由此可見，結合應用CMA技術和QF-PCR技術對流產胚胎絨毛進行檢測，能克服傳統細胞遺傳學方法的缺點，提高檢測的成功率和異常率。然而QF-PCR技術及CMA技術不能檢測染色體結構異常，對多倍體及低比例嵌合體檢測不敏感。因此，我們也不能排除在CMA結果為未見異常CNVs的病例，存在以上情況的染色體異常。

3.2 染色體非整倍體異常是自然流產的主要病因

本研究中，流產胚胎絨毛染色體異常發生率為67.46%，以非整倍體異常為主。其中，又以常染色體三體及性染色體單體常見。與既往研究報道[12-13]相符。這種染色體數目畸變的主要發生源自雙親之一方的配子形成時或妊娠初期受精卵卵裂時出現了某號染色體不分離，則導致該染色體增多或減少一條。本研究發現自然流產胚胎絨毛的非整倍體異常發生在除1號、3號、5號、12號、19號以外的染色體上，并且具有明顯的集中性。根據以往報道，近90%的三體型發生于13號、16號、18號、21號、22號上[14]。本研究中以上染色體占所有三體的發生率雖然僅為57.58%，但也能清晰反映這種集中性的存在。出現這種情況的機制目前尚不明確，尚需要得到更多的流行病學資料支持。

3.3 孕婦年齡與流產的關系

3.3.1隨著孕婦年齡增長，胎兒染色體非整倍體異常的幾率增高

一般認為孕婦高齡是染色體異常胎兒發病率高的原因之一。本研究中自然流產孕婦的年齡中位數為31歲。從表5可以看出，年齡在25歲以下的孕婦，流產胚胎絨毛CMA檢出50%為染色體數目異常；年齡在25歲以上的孕婦，流產胚胎絨毛CMA結果提示染色體數目異常的比例隨著孕婦年齡增長明顯增高。由此可以推斷，隨著孕婦年齡增長，胎兒發生染色體數目異常的幾率增加。這是因為，隨著孕婦年齡增長,卵巢微環境發生改變,卵母細胞逐漸老化[15]。老化的卵母細胞中染色體紡錘體也隨之老化，致使分裂時染色體不分離的幾率增高。

3.3.2孕婦年齡增長對致病性CNVs的檢出影響不大

年齡在25歲以下的孕婦，流產胚胎絨毛CMA檢出14.29%為致病性CNVs，明顯高于其他25歲以上孕婦。盡管25歲以上孕婦，流產胚胎絨毛CMA結果為未見異常CNVs的比例隨著年齡的增長而減少，但檢出致病性CNV及VOUS的比例并沒有隨孕婦年齡增長出現明顯變化。這可能是因為本研究中該年齡段孕婦例數較少所致，需要通過樣本量更大的研究來完善并作出更準確的推斷。綜合上述情況，孕婦年齡增長是導致自然流產的原因之一。

3.4 胚胎性別與流產的關系

女性胚胎更容易發生染色體數目異常。男性胚胎，則更容易發生染色體數目異常以外的染色體異常。本研究按照CMA結果進行分組并對各組不同胚胎性別進行比較，發現在CMA結果為未見異常組及VOUS組中，男性胚胎比例明顯高于女性胚胎，此現象在VOUS組更為突出；然而，在染色體數目異常組中，女性胚胎比例高于男性胚胎。未見異常組與染色體數目異常組性別比較差異有統計意義。CMA結果未見異常組的性別差異，提示在男性胚胎中還存在染色體異常之外的其他誘發自然流產的重要機制。此研究結果與既往研究報道的結果[16-17]不相符。我們考慮：一方面，既往研究主要采用傳統的細胞遺傳學方法對自然流產胚胎絨毛進行檢測，無法排除母體組織污染造成結果誤判導致的女性胚胎結果增多。而且傳統的細胞遺傳學方法無法檢測5Mb以下的染色體異常，可能對統計胚胎性別造成干擾。另一方面，CMA技術的缺陷導致漏檢染色體結構異常、部分多倍體及低比例嵌合等的異常，也會對胚胎性別統計結果造成干擾。同時，對于CMA檢測出的VOUS，其對自然流產的致病性尚不明確，尚需要進一步研究。因此，應用CMA技術對胚胎性別與自然流產關系進行研究，需要結合傳統細胞遺傳學方法及采集更多的流行病學資料，才能得到更全面的分析結果。

綜上所述，隨著孕婦的年齡增長，胚胎發生染色體非整倍體異常幾率增多，胚胎發生染色體微缺失/微重復異常幾率則未見受到影響。自然流產中胚胎是否存在性別特異性淘汰現象在本研究中未能確定。CMA技術，作為一門新發展的技術，是傳統的細胞遺傳學技術的有益補充。其結合QF-PCR技術應用于自然流產病因分析上，能突破傳統細胞遺傳學技術的局限性，快速、準確檢測出染色體的非整倍體異常，并能更精確細致地檢測出染色體微缺失/重復異常，建議作為傳統細胞遺傳學方法的補充。同時，我們也建議，醫師在給患者臨床咨詢意見時，對于流產胚胎絨毛CMA結果檢出致病性CNVs的患者，尤其是致病性CNVs片段長度在5Mb以上的，應該結合夫婦雙方外周血染色體核型結果進行全面分析。