石榴耐鹽堿研究進展

唐海霞,陶吉寒,馮立娟,王中堂,尹燕雷

山東省果樹研究所,山東 泰安 271000

土壤鹽漬化是影響農業生產的世界性問題[1]，鹽度被認為是最重要的非生物脅迫之一[2]，全球近20%的耕地和近半數的灌溉土地都受到不同程度的鹽害威脅[3]。鹽堿脅迫影響著果樹產量、蛋白質合成、光合作用以及能量代謝。蘋果、桃等大宗水果耐鹽量不超過0.3%[4,5]，而石榴（Punica granatumL.）在0.5%濃度下能正常生長[6]。堿脅迫與鹽脅迫相伴生，堿脅迫誘導的抑制效應總體上高于鹽脅迫[7]。耐鹽/堿基因表達、無機離子的選擇吸收、滲透物質調節和抗氧化物的合成是石榴耐鹽堿的關鍵。解析石榴耐鹽堿的生理和分子機制對規范或提升石榴在鹽堿地栽培技術，通過分子手段改良和選育耐鹽堿石榴新品種，加快石榴在鹽堿地上的規模化栽培有重大意義。

1 鹽、堿脅迫對石榴生長的影響

1.1 石榴的耐鹽堿能力

土壤中較多的鹽堿通過引起離子毒害[8]、滲透脅迫[9]、氧化脅迫[10]和高PH[11]等方式影響植物的生長和發育。果樹屬于對鹽敏感的植物，生長極限鹽度小，平均為1.4 dS·m-1（0.098%）[1,12]。但是，石榴能夠抵抗中度鹽脅迫（≤300 mmol·L-1(1.76%）[13]鹽脅迫，Bhantana and Lazarovitch[14]對0～8±1.5 dS·m-1鹽脅迫后植株電導率、蒸散量和生長系數進行研究后將石榴列為中等鹽敏感植物。筆者以1年生‘泰山紅’為試材，進行不同濃度NaCl 和混合鹽堿處理，結果表明，當單鹽濃度在200 mmol L-1（1.17%）以下時，能較好的生長；當鹽堿交互脅迫后，NaCl 濃度在200 mmol L-1、pH 8.72 時，苗木受害嚴重；混合鹽堿對苗木脅迫要高于單鹽[6]。當前，關于鹽堿脅迫研究存在度量單位不統一的情況，鹽水的濃度與測試土壤實際鹽濃度有較大誤差。因此，評價植物耐鹽堿能力時以土壤中鹽濃度為標準較為適宜。

1.2 鹽脅迫的影響

鹽脅迫對石榴的影響分為直接影響和間接影響。高Na＋、Cl-等離子在植株體內積累[9]，一是破壞葉片結構，影響光合、呼吸、和蒸騰速率，降低產量[15,16]，二是打破植物體內的離子和水勢平衡，大量的Na＋、Cl-競爭取代植物生長所必需的K+、Ca2+、Mg2+等元素，抑制細胞內多種酶的活性及蛋白質的合成等，干擾正常的代謝過程，引發生理生化紊亂等[17,18]，對植物產生直接影響。Naeini[19]研究了4 個鹽度水平下3 個石榴品種葉片和根系Cl、Na、K 的分配和枝條生長的影響表明，NaCl濃度的升高，降低了莖高、節間的長度和數量以及葉片表面積。高濃度的鹽脅迫通過引起土壤水勢下降對植株造成間接影響。鹽脅迫下，根系吸水困難，造成植株生理干旱，植株為限制水分缺失，會關閉氣孔，葉片的光合速率受影響[20]。Khayyat M,et al.[21]對兩個石榴品種進行不同鹽濃度脅迫發現，隨鹽濃度升高，Na+、Cl-分別在莖、葉中大量積累，根系相對含水量和葉片氣孔導度均明顯降低。

1.3 堿脅迫的影響

濱海鹽堿地上，石榴堿脅迫通常與鹽脅迫相伴產生。鹽脅迫主要由中性鹽如NaCl、Na2SO4造成，而堿脅迫主要由堿性鹽，如碳酸氫鹽和碳酸鹽造成[22]。堿脅迫在鹽脅迫的基礎上又增加了高pH 對樹體的傷害。鹽堿脅迫對石榴生長的影響更為復雜和嚴重。高pH 脅迫不僅直接影響根系營養和水分吸收，同時也會對根系組織結構造成傷害[23]，根系吸水困難，干枯；葉片氣孔關閉，枯萎，落葉[24]。土壤過堿，還會導致土壤理化性質的改變，表現為土壤有機質含量低，板結，通氣、透水性差，肥力降低等，造成土壤和植物的抗逆性減弱，生產能力降低[25]。

2 石榴耐鹽堿生理機制

2.1 耐鹽性機制

石榴在長期的進化過程中，形成獨特的生理機制來應對鹽脅迫。在鹽脅迫條件下，石榴通過降低根對Na+的吸收以及阻止離子向地上部的運輸減少鹽害[26]。隨著土壤中NaCl 含量的增加，石榴根、枝的K+、Na＋含量均有所增加；當NaCl 含量為0.4%時，K+含量最高，隨后開始下降[27]。Na+、K+經過石榴根系時，K+優先被吸收，進入木質部，Na+、K+從根系向枝條運輸及從枝條木質部向韌皮部轉運時，K+優先向地上部及枝條韌皮部積累，而Na+分別在根韌皮部及枝條木質部大量積累[28]。

植物遭受鹽脅迫后會引起膜質過氧化，產生多種形式的活性氧（ROS）。面對脅迫植物生成滲透應激蛋白如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶等，植物體內原來積累的大分子物質淀粉、蛋白質分解成小分子物質糖、氨基酸等，一些滲透調節物質相繼生成，如脯氨酸、甜菜堿等積累[29-30]。抗氧化酶和滲透調節物質協同來清除活性氧，解除ROS 對細胞造成的損害[31]。研究表明，鹽脅迫下甜菜堿處理對石榴種子萌發和幼苗生長有顯著影響，甜菜堿處理能夠有效提高石榴幼苗葉片抗氧化酶活性，促進可溶性糖和脯氨酸積累，減少丙二醛（MDA）和過氧化氫（H2O2）積累[32]。劉翠玉等[13]對3 個石榴品種鹽脅迫后生理生化研究顯示：隨著鹽濃度增大，石榴體內脯氨酸、MDA 顯著升高；可溶性蛋白先降低后升高；SOD、CAT 活性先升高后降低，NaCl 濃度300 mmol·L-1時達到最大值。這表明，在一定的NaCl 濃度下，石榴通過滲透應激蛋白及有機質的積累增強滲透調節能力，減輕鹽脅迫對植株的傷害。

2.2 耐堿性機制

在堿性土壤下，石榴不僅要應對鹽的脅迫，還要應對高pH 對根組織結構的傷害[33]。關于石榴在堿脅迫下的生理機制還未見報道。在堿脅迫條件下，水稻、棉花等植株莖和葉中的Na+累積明顯高于鹽脅迫。當脅迫強度較大時，大量的Na+便會在葉片中積累，破壞葉綠體結構，從而影響光合作用[34]。研究表明，植物根系對周圍高pH 值環境的應答除了離子的轉運，另一重要方面是有機酸的分泌[35]，如蘋果酸等。植物分泌有機酸不僅可以維持細胞內pH 穩定和離子平衡，還在根外pH 調節中起重要作用[36]。徐華華[37]在堿脅迫對虎尾草有機酸代謝研究中表明：在堿脅迫下，虎尾草有機酸含量顯著上升，其中檸檬酸、蘋果酸增幅最顯著；蘋果酸合成酶、檸檬酸合成酶和異檸檬裂解酶是有機酸代謝的關鍵酶。

3 石榴應對鹽堿脅迫的分子機制

植物的耐鹽堿性是由多基因控制的數量性狀，其分子機制非常復雜。鹽堿脅迫通常相伴產生，堿對植物的傷害往往更高于單鹽的脅迫。鹽堿脅迫條件下，植物離子選擇吸收、滲透調節物質合成、抗氧化保護酶、信號轉導蛋白作用相關的基因相繼被發掘。目前，石榴耐鹽相關基因的研究才剛起步，因此，本文基于其他作物耐鹽堿分子機制的研究，以期為石榴耐鹽堿相關基因的研究提供參考。

3.1 離子轉運相關基因

鹽堿脅迫對植株產生離子毒害，植株根系通過調節離子進出來維持細胞或組織離子穩態,其中維持Na+-K+平衡、植物應激反應的信號轉導是植物抗鹽堿的最主要因素[22]。Na+、K+離子轉運主要由離子轉運蛋白進行控制。研究表明，棉花和小麥中過表達AtNHX1（液泡鈉離子和氫離子反向運輸體）基因對提高植物耐鹽性有重要作用[9]。該基因具有隔離液泡中鈉離子的能力，有效防止Na+在細胞質中的積累[38]。水稻體內的Na+和K+的吸收由OsHKT1 和AtHKT1 轉運蛋白來完成，在K+虧缺時，OsHKT1 在水稻根中特異性介導Na+的轉運，而AtHKT1 對K+具有高親和性，可轉運K+和Na+[39,40]。擬南芥AtCPK6 基因屬于應激誘導的鈣依賴蛋白激酶(CDPK)家族，將該基因轉擬南芥進行過表達，鹽脅迫后的脯氨酸和丙二醛(MDA)的變化表明，過表達植株對鹽/干旱脅迫的耐受性增強[41]。Zhu,JK,et al.[42]通過對擬南芥突變體進行篩選，獲得了28 個SOS1 突變體、9 個SOS2 突變體和1個SOS3突變體，分析表明，SOS 基因具有相同的功能通路，SOS1、SOS2、SOS3 突變體的耐鹽性與其K+含量有關，而與Na+含量關系不大。當細胞內pH 發生變化或高Na+后，在細胞膜上就會觸發細胞內信號級聯，產生次級信使分子（Ca2+和質子）等。Shi HZ,et al.[43-45]對擬南芥SOS 突變體基因進行分析顯示，當細胞感知到較高濃度的Na+后，細胞質內Ca2+會大量富積，SOS3 便結合游離的Ca2+并激活SOS2 蛋白激酶，活化的SOS3，SOS2 激酶復合體可以激活質膜上的Na+/H+轉運蛋白SOS1，SOS2同樣也可以激活液泡膜上的Na+/H+轉運蛋白AtNHX1 和Ca2+/H+（CAX1）轉運體[46]。

3.2 滲透脅迫相關基因

參與滲透調節的物質主要分為無機離子和體內合成的有機物質，如脯氨酸、甜菜堿等。吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯氨酸合成的限速酶。張兆元等[47]從NaCl 處理的野生大豆中克隆得到脯氨酸合成酶基因GsP5CS，表明該基因受鹽脅迫誘導上調表達，NaCl 濃度200 mmol/L、300 mmol/L時相對表達量分別為對照的5.83 和12.78 倍。該結果也證明了GsP5CS基因與野生大豆體內脯氨酸的合成具有高度相關性。膽堿單氧化酶CMO 基因和甜菜堿醛脫氫酶基因BADH 是甜菜堿生物合成過程中關鍵酶，徐冰等[48]對轉CMO-BADH 雙基因、轉CMO 基因和非轉基因草地早熟禾進行不同梯度的NaCl 脅迫，通過細胞膜透性、酶活性變化，評價2 種基因的轉化對植株耐鹽能力的差別，結果表明雙轉基因>單轉基因>非轉基因。Takahashi M,et al.[49]把能夠合成大麥麥根酸的基因NaatA和NaatB轉入到水稻體內，發現生長在堿性土壤中的轉化株產量比非轉化株高4.1 倍。

3.3 抗氧化脅迫基因

在鹽堿脅迫下，植物會啟動酶促系統和非酶促系統來防止活性氧危害。非酶促系統主要包括參與活性氧清除的抗氧化物，如抗壞血酸、谷胱甘肽等。酶促系統指參與保護反應的酶類，如有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH））等[50]。付暢[51]分析了西伯利亞蓼PsMnSOD基因在鹽堿脅迫下的表達，研究結果表明，PsMnSOD基因在酵母中的表達提高了酵母在鹽堿脅迫下的SOD 酶活性，指出該基因在抵御鹽堿脅迫中起到非常重要的作用。APX 是清除鹽堿脅迫產生的H2O2的主要酶類，對抗壞血酸具有很高的特異親和性[52]，該基因在朝鮮堿茅中得到分離克隆，構建酵母表達載體YES2-PutAPx，導入酵母IVSC1 菌株后在半乳糖的誘導下分析具有抗氧化性[53]。在土豆和擬南芥CDPKs中，OsCDPK12通過誘導ROS 清除基因OsAPX2/OsAPX8的表達來減少鹽脅迫下H2O2積累對植株的傷害[54,55]。

4 生物技術在石榴上的應用

近年來，隨著現代生物技術尤其第三代測序技術的迅速發展，利用生物技術進行植物耐鹽育種己經越來越普遍。石榴是公認耐鹽堿性較強的樹種，但對其耐鹽堿機理及分子調控機制還未明確。雖然石榴耐鹽堿分子機制研究起步較晚，但隨著石榴全基因組的破譯及抗逆基因的不斷發現，石榴現代生物育種可以從以下兩個方面實現突破：

（1）組織培養與突變體篩選。利用組培快繁的技術，將石榴組織接種在含鹽培養基上，通過鹽濃度的升高，直到組織達到95%的死亡水平，后通過幾次無鹽溶液培養，然后返回到有鹽溶液中進行檢驗[56]。通過此種方式可篩選具有耐鹽基因株系進而獲得耐鹽良種；

（2）利用基因工程手段進行石榴耐鹽育種工作。通過鹽脅迫，篩選耐鹽基因，通過操縱這些基因的表達來提高石榴的耐鹽性[57]。從耐重鹽的植株中篩選耐鹽基因，轉基因到石榴苗中，亦可獲得耐鹽新品種。此種方法在楊樹中已獲得成功[58]。彭媛媛等[59]以‘紅玉石籽’籽粒為材料，通過RACE技術克隆了石榴GPX（谷胱甘肽過氧化物酶基因）基因，利用Real-time PCR 檢測該基因在鹽脅迫下石榴葉片中的相對表達量，結果顯示鹽脅迫下，PgGPX表達量顯著上升，推測PgGPX基因在鹽脅迫反應中可能發揮重要作用。

5 展望

濱海鹽堿地土壤一般是鹽和堿脅迫同時存在，且石榴耐鹽堿性與高、低溫，干旱等脅迫密切相關[60]，因此，石榴耐鹽堿生理機制十分復雜。目前石榴的耐鹽堿性主要通過植株形態、生長狀況及生理生化等指標的變化來鑒定。在石榴耐鹽堿評價上，鹽、堿脅迫梯度、苗木發育期、耐鹽指標的調查、評價方法等方面對實驗結果均具有顯著影響[6]。因此，石榴耐鹽堿評價體系亟需建立。

石榴耐鹽堿分子及遺傳多樣性研究需繼續深入。世界石榴分子生物學的研究要遠遠落后于蘋果、桃等大宗水果的研究，鹽堿脅迫下的石榴分子生物學研究更是剛剛起步。石榴作為鹽堿地栽植的先鋒樹種，提供了豐富的耐鹽堿基因。加大對石榴分子生物學的研究，不僅有助于培育耐鹽堿石榴良種，更為我國鹽堿地的果樹改良和治理提供理論基礎，具有重大的經濟價值和生態效應。