Ⅱ型膠原誘導關節炎小鼠和大鼠模型述評

陶 寧,張 杰

(1中國醫科大學第一臨床學院中醫科,沈陽 110001;2中國醫科大學附屬第一醫院中醫科;*通訊作者,E-mail:zhangjie945@126.com)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關節滑膜長期慢性炎癥為基本病理改變的系統性多關節炎,其臨床多表現為對稱性、侵襲性小關節炎癥,可累及到關節外器官,導致關節畸形和強直,但發病機制尚不明確。為深入研究RA的發病機制、病理變化、藥物篩選以及免疫治療等方面,選擇合適的類風濕關節炎動物模型尤為重要。Ⅱ膠原誘導的關節炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型是以慢性、多發性末端關節炎,甚至關節損傷等表現為主的免疫性炎癥模型,其臨床表現和病理改變等方面與RA有諸多相似之處,是研究RA的金標準模型[1]。

Trentham等[2]1977年首次報道了CIA模型,該模型的發病機制包括體液免疫和細胞免疫兩個方面。在體液免疫中,異種動物Ⅱ型膠原蛋白(type Ⅱ collagen,CⅡ)注入動物體內后,活化B淋巴細胞產生的特異性膠原蛋白抗體在關節部位與膠原蛋白結合形成免疫復合物活化了補體系統從而產生免疫反應,其中Th1型細胞因子通過增加MHC-Ⅱ和黏附分子的表達,促進抗原遞呈活化巨噬細胞,在CIA的發生發展中發揮著重要作用[3-5]。然而,并非所有產生抗Ⅱ型膠原抗體的動物都出現關節炎,抗體滴度與關節炎的嚴重程度也并非成正比,這說明單一的體液免疫并不能完美詮釋CIA的發病原因,需結合細胞免疫進行綜合分析。在細胞免疫中,T細胞上的CD4分子和T細胞受體(TCR)識別與抗原片段結合的MHC分子,分泌細胞因子,促進該抗原的細胞和體液免疫反應,提示T細胞反應在CIA的發病中起重要作用,這與類風濕關節炎患者免疫學改變相似[6-8]。

目前,無論是在RA的免疫研究、新藥研發與篩選還是療效評價等方面,CIA模型都是最理想的類風濕關節炎實驗動物模型[9,10]。本文闡述了影響該模型成功建立和成模率的主要因素以及需注意的問題。

1 鼠種的選擇

目前,國內外CIA造模采用的實驗動物多為大鼠或小鼠,其優點在于高度的遺傳背景同質性、低成本和易處理。在CIA的致病能力方面,二者及其各自種系間又存在差異。不同種系小鼠對CIA的敏感度不同[7],這是因為Th1型細胞因子通過增加MHC-Ⅱ和黏附分子的表達來影響CIA的發生發展[11],CIA動物的敏感性也與其特定基因MHC-Ⅱ的表達息息相關[12,13]。研究表明,MHC表現為H-2r、H-2q的單倍型小鼠對CIA易感性最強,如DBA/1(H-2q)、B10.RⅢ(H-2r)小鼠;而MHC表現H-2b、H-2d的小鼠,對關節炎膠原誘導具有相對抵抗性,屬于易感性較差的品系,如C57BL/6(H-2b)、BALB/c(H-2d)小鼠[12,14,15],亦可在膠原蛋白誘導下發生關節炎。因此,近交系DBA/1、C57BL/6J、BALB/c是目前國際認可的CIA模型小鼠。

DBA/1小鼠作為CIA經典模型鼠,其關節炎程度較重,出現滑膜炎、軟骨和骨侵蝕等類似于人RA的病理變化,成模率高達90%-100%,且關節炎癥狀表現及嚴重程度差異性小[15,16],盡管存在價格昂貴、飼養條件要求高、臨床表現持續時間較短等缺點,但DBA/1小鼠仍是CIA實驗動物的佳選;C57BL/6(H-2b)和BALB/c(H-2d)小鼠,均屬于不易感品系,其中C57BL/6品系對雞Ⅱ型膠原可產生強烈且持續的T細胞反應而引發關節炎,常規造模方法成模率可達50%-70%,但有文獻指出改進免疫方法即基礎免疫后第21天在其后足(替代尾根部)注射膠原乳劑,其成模率可提高到100%。C57BL/6(H-2b)小鼠的優點在于其炎癥持續時間較DBA/1小鼠更長,且大多數轉基因和基因敲除的小鼠都是在其背景上實踐的,更適合作為類風濕關節炎發生機制研究和藥物開發的動物模型[17,18]。不足之處在于C57BL/6鼠種關節炎表現僅在后足,腫脹程度差異性較大,且性情暴躁,易造成動物死亡和實驗人員受傷,影響實驗結果。BALB/c鼠作為CIA實驗動物的研究較少,有文獻指出該鼠造模具有重現性好、周期短、經濟實用、成模率較高等優點[19],但實驗例數較少,其準確性有待進一步證實。

大鼠受MHC基因類型的影響較小,具有較廣的種系范圍,如遠交系DA大鼠、SD和Wistar大鼠、近交系Lewis大鼠等。其中遠交群SD和Wistar大鼠因其適應力強,繁殖快,足爪紅腫明顯,關節畸形,軟骨表面較明顯破壞,慢性病程,治療耗時長(連續觀察21周)等與RA相似的特點被國內高頻率應用[8,20],但大鼠的實際成模率不如小鼠,始終未達到100%成模。

2 鼠齡的選擇

據統計,在人類RA患者中,40-65歲為高發年齡段,提示年齡在RA的發生發展過程中的影響存在差異。在動物實驗中,小鼠應至少7-8周齡才易被誘導產生關節炎,因為此時的小鼠才具有成熟免疫系統[21]。以常用的高敏感性DBA/1小鼠為例,要達到90%-100%的高成模率,一般選6-8周齡;低敏感性的以C57BL/6小鼠為例,其在12-14周齡會有50%-60%較高成模率[22,23]。老年小鼠亦可用于造模,但其發病率和嚴重程度均不佳。在大鼠方面,幼年大鼠明顯較老年大鼠更容易誘發關節炎。以常用的Wistar大鼠和SD大鼠為例,研究表明4-5周齡Wistar大鼠建模成功率達83.3%[8],6周齡Wistar大鼠CIA造模成功率可達92%[24]。4周齡SD大鼠成模率可達90%[20],5-6周齡SD大鼠的成模率約為75%[25]。由此可見,鼠齡對CIA模型的成模率有重要影響。

3 性別的選擇

在臨床中,女性RA患病率約為男性患者的4倍[26]。在動物實驗中,雌性大鼠較雄性更容易誘導關節炎[8],這一點也與人體RA的男女患病比率相似;而在小鼠中,最新文獻[27,28]提示雄性小鼠具有較高的膠原蛋白性關節炎易感性,其發病率和嚴重程度均高于雌性小鼠,高應答品系DBA/1、B10.RⅢ雄性小鼠的CIA成模率可達90%-100%,分析其原因可能有以下兩方面:一是高濃度的雌激素可抑制細胞介導的免疫反應,雌激素的代謝產物亦可降低滑膜組織的炎性程度[29],提示雌性鼠CIA成模率較低可能與其體內較多的雌激素有抑制關節炎的作用有關;二是雄鼠之間的互相攻擊會增加其對CIA的易感性,并且對嚴重的自發性肌腱附著點病變的發展具有促進作用[30]。但雄鼠間過度打斗的致傷、致殘、致死會影響實驗結果的準確性,實驗中應當避免此類情況發生。以上均說明性別差異會影響造模成功率。此外,另有研究表明低應答品系C57BL/6小鼠應用于CIA造模時雌雄小鼠的發病率和嚴發重程度差異不明顯,其中雌性小鼠占46%,雄性小鼠占54%,提示該鼠性別的差異對于CIA模型成模率的影響較小,可忽略不計[23]。

4 CⅡ來源及濃度的選擇

不同來源的CⅡ會造成鼠對其免疫應答及關節炎發展方面的差異。對于小鼠而言,即使易感性高的DBA/1和B10.RⅢ小鼠用同源性的Ⅱ型膠原免疫,其CIA發病率仍然非常低(約10%)[31]。而對于大鼠,自體大鼠CⅡ可用來免疫大鼠誘導關節炎模型[2]。因此,誘導大鼠的CIA,選同源或異源性Ⅱ型膠原均可;而誘導小鼠的CIA,則僅可選用異源性CⅡ(如牛、雞、豬源)誘導關節炎[32-34]。一般說來,豬源性CⅡ中最易誘發關節炎,其次是牛源性CⅡ,雞源性CⅡ致炎效果最差[35]。然而,不同品系小鼠對來源性CⅡ的敏感度存在差異,如DBA/1小鼠對雞、牛、豬和人源性CⅡ都具有高敏感性,大鼠與DBA/1小鼠相似,對人源性CⅡ敏感度稍差;B10.RⅢ小鼠對牛和豬源性CⅡ有強反應,但對雞型和人源性CⅡ的反應較差[15,35];而易感性差的C57BL/6小鼠對雞源性CⅡ有強烈的免疫應答[17]。在CIA造模實驗中,高成模率的DBA/1小鼠通常選擇雞或牛源性CⅡ,具有CIA抗性的C57BL/6小鼠則選雞源性CⅡ,這兩種CⅡ在大鼠造模中均被高頻率應用。

除了CⅡ的來源不同會影響鼠成模率,CⅡ的濃度也是影響鼠CIA高成模率的關鍵。經研究發現,采用同種CⅡ造模,其發病率也會因其濃度的不同而異,高濃度CⅡ免疫的大鼠發病率更高[27]。因此,只有CⅡ達到一定濃度時,才能誘導T細胞,激發其對自身CⅡ的免疫反應而誘發關節炎。相關文獻[16,22]提示高應答品系小鼠的成模率高達90%-100%,注射膠原的濃度為2 mg/ml;低應答品系小鼠的成模率為50%-70%,注射膠原的濃度為2.5 mg/ml。但需注意的是當CⅡ濃度過大時,可能會引起實驗動物關節部位嚴重的炎癥反應,影響實驗的順利進行。因此在配制乳劑時,應根據實際情況選擇合適濃度的CⅡ。

5 佐劑的種類與濃度的選擇

佐劑分為弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)和弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant,IFA)兩種,佐劑的選擇及其濃度的大小直接影響著CIA的發病率。兩種佐劑均為淡黃色透明溶液,二者區別的關鍵在于CFA含有結核分枝桿菌的細胞壁成分,該成分能有效地誘導產生高滴度抗體,加強對抗原的抗體反應。補體的激活須有抗原抗體復合物的參與,誘導關節炎的重要步驟正是激活補體系統;而IFA只含有礦物油成分,僅可協助抗原刺激機體產生抗體應答,一般用于加強免疫[36]。因此CFA與CⅡ乳化后免疫的小鼠能更迅速地誘發為嚴重的關節病變,如滑膜增生、單核細胞浸潤、軟骨降解等[37,38]。小鼠第0天進行首次免疫應選擇CⅡ與CFA充分乳化,第21天進行加強免疫時則可根據小鼠的狀態選擇CⅡ與CFA或IFA乳化,大鼠免疫所選擇的佐劑與小鼠相同[39,40]。兩次免疫均用CFA時,小鼠可能會出現強烈的炎癥反應,考慮小鼠品系及發病率的問題,敏感性高的小鼠加強免疫一般可采用IFA加強免疫,敏感性低的小鼠則考慮繼續采用等劑量CFA。

確定兩次免疫所需的佐劑之后,其次確定的就是佐劑的濃度。低應答小鼠品系以C57BL/6為例,常規免疫方法要達到60%左右的高發病率時,每只鼠注射的膠原乳劑中CFA的濃度為5 mg/ml[14-18];對于高應答品系,如DBA/1小鼠,發病率要達到90%-100%時,每只鼠注射的混合乳劑中CFA的濃度為4 mg/ml[21,22]。值得注意的是佐劑濃度偏高時可能導致注射部位潰爛,甚至實驗動物死亡。

6 實驗操作過程

準確而嚴謹的實驗過程及操作是CIA模型成功建立和高成模率的基礎。以小鼠為例,在無菌避光條件下,將CⅡ(雞或牛)粉末溶解于0.02 mol/L冰醋酸溶液中,使其形成終濃度為2 mg/ml的溶液,研磨攪拌均勻置于4 ℃冰箱過夜,第2天在相同條件下,將CⅡ溶液與等體積的濃度為4 mg/ml的CFA溶液在冰上充分混合乳化形成白色乳劑。第0天每只小鼠于靠近尾根部約1-2 cm處兩點或多點皮內注射0.15 ml乳劑進行初次免疫,第21天以同樣的方法進行加強免疫,每只小鼠注射0.1 ml,該乳劑-80 ℃可保存1周,若二次免疫后CIA模型未成,可繼用本次配好的乳劑再補一次免疫[21,32]。大鼠的操作過程與小鼠大致相同,需根據大鼠的體重調整注射劑量。在造模操作過程中,還有以下三點需要特殊注意。

6.1 Ⅱ型膠原的保存

除了選擇適合的Ⅱ型膠原蛋白,正確的保存方法也是CIA高成模率的關鍵。文獻指出CⅡ是一種無色透明的溶液,應置于-4 ℃黑暗的條件下短期保存,保存時間為2個月以上者,應避光保存于-20 ℃冰箱中[22,41]。液體若出現渾濁,則表明它可能已經交聯沉淀,或者受到污染,變性的CⅡ將難以形成乳劑而致小鼠、大鼠CIA不成模或成模率極低。建議將膠原蛋白溶液以小等份試樣的方式儲存,以便解凍所需的實驗量,變性的膠原應棄之勿用。

6.2 乳化的條件

乳化的是否充分直接影響CIA造模的成功率。首先,保持CⅡ的抗原特性是至關重要的一步。酸性溶液中的凍干膠原蛋白和膠原蛋白溶液在-20 ℃下黑暗中穩定,新配制的膠原蛋白溶液可以在4 ℃保持一周,但之后應密封保存在-20 ℃。其次,選用乳化的方法也尤為重要。通常有以下3種:①研磨法是將等體積抗原與佐劑分別研磨后加入冰浴研缽中不斷研磨,直至溶液成白色乳滴狀。此法適用于大批量乳劑的制備,雖然乳化比較完全,DBA/1小鼠成模率可達100%[42,43],但形成黏稠的乳化物會大量地附著在研缽壁上,乳劑回收率較低,且乳化時間需要2 h左右,耗時耗力。此外,根據個人造模經驗,在單獨研磨膠原溶液時,由于室內濕度溫度的影響可能出現膠原內液體蒸發現象而導致乳劑制備失敗。②注射器混合法利用橡皮管將兩個5 ml注射器連接在一起作為乳化的工具,將抗原和佐劑在冰浴環境中進行互推,反復抽吸,直至形成白色乳劑[15]。此法適用于小劑量乳劑的制備,雖然避免了研磨法可能出現抗原液體蒸發的情況,也解決了乳劑回收問題,但乳化過程耗時費力,且難以乳化完全又不穩定。③超聲勻漿法操作簡便快捷,但產熱較大,且超聲會將膠原分成多個片段,而小片段膠原在正常體溫下易變性,結果較不理[33,38]。

據文獻提示,電動攪拌器被強烈推薦用于膠原乳劑的制備[41]。中山大學黃小榮等[44]的實驗室在電動攪拌器的基礎上進行整合改進,研究出了一種省時省力又避免膠原浪費的膠原乳化的方法,即電動佐劑攪拌器與注射器結合法。將抗原和弗氏佐劑加入30 ml針筒中,再用電動佐劑攪拌棒進行混合乳化。該法不但有效地規避了以上幾種方法的弊端,而且效率高,便于操作、清洗和消毒,乳劑可充分乳化且回收率高,值得借鑒學習。

6.3 注射部位及方法

大量文獻[8,12,14,16,22,39,45]提示,CIA造模選取注射的部位為鼠的尾根部。背部注射也能誘導關節炎,但需要更多膠原乳劑;腹腔注射乳劑時,胸膜和腹膜會發生強烈的炎癥反應,因此不建議采用這兩種注射部位[46]。鼠的毛比較茂密,為了方便操作,注射前須剃掉尾根部周圍的毛,勿損傷小鼠皮膚。乳劑應保證注射到皮膚內淺表部位,并維持在小鼠尾根部皮內區域,不應在其體內移動,注意避免刺入尾根部附近的臟器組織。注射的位置不當會導致尾根部皮膚潰爛嚴重甚至脫落且成模率低,若不慎將乳液注入尾靜脈,則會導致小鼠迅速死亡[41]。

目前,CIA造模常用注射方式有兩種,即皮下注射和皮內注射[47-49]。皮下注射是指將乳劑注射到皮下組織,即淺筋膜,位于皮膚與深筋膜之間,由疏松結締組織和脂肪組織構成。該方法雖操作和進針較容易,可注射較多液體,但不能精確地定位藥物作用的部位且吸收快;皮內注射是指將乳劑注射到表皮和真皮之間,真皮為含有大量纖維成分的致密結締組織。本法操作和進針較皮下注射困難且藥物的注射量較少,但乳劑可主要集中于注射部位,定位較準確,并且吸收速度較慢,可以對機體產生較為長久的刺激,促使機體對刺激產生反應。綜上,兩種方法雖然均有利弊,但結合文獻及CIA造模的成功率,皮內注射為最佳選擇。

7 結語

目前,國內外已探究多種動物模型用于RA病因以及發病機制的研究,包括佐劑誘導關節炎、鏈球菌細胞壁(SCW)誘導關節炎、K/BxN小鼠模型等。與之相比,CIA雖制備方法較古老,但以其高度可重復性以及可操作性的優勢,仍是RA臨床和基礎研究中最經典、最理想的實驗動物模型,為RA尋找新的治療靶點及新藥的驗證,更好地轉化為臨床應用,提供了寶貴的實驗及理論基礎。本述評為了各實驗室能夠進行高效且成功的CIA小鼠和大鼠造模實驗,詳細地評述了該模型在建模過程中材料的選擇以及操作過程,將實驗中的細節進行量化、規范化,避免實際操作中因失誤所導致的造模失敗,以期對相關領域研究者的基礎實驗提供借鑒。