IVF-ET 中受精失敗高危因素及后續(xù)處理的研究進展

胡瑞雪 ，霍鵬 ，張順

（1.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心， 廣西 桂林；2.桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，廣西 桂林）

0 引言

世界衛(wèi)生組織表明不孕癥已成為世界第三大頑疾，2017年的生育調查發(fā)現(xiàn)我國育齡夫婦中不孕率已高達25.44%[1]。雖然IVF-ET技術是當前治療不孕癥的主要手段，但受限于目前技術，IVF-ET中大概仍然有10%-15%的FF，包括完全受精失敗（total fertilization failures，TFF）和部分受精失敗，TFF指全部卵母細胞均未受精(受精率=0%)，部分受精失敗指卵母細胞受精率≤25%[2]。現(xiàn)今已知的受精過程包括有精子獲能、卵丘穿透、精卵融合、皮質卵丘釋放、第二極體（2PB）釋放及雌雄原核的形成等，且其任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均可能導致FF，因此影響受精的因素必然是眾多的。對于FF者將被迫面臨無胚可移、取消周期、經濟損失等風險，這無疑對患者和醫(yī)務工作者都造成了一定的創(chuàng)傷。

為明確FF的原因，國內外多個前瞻性及回顧性研究探討了與FF相關的高危因素，但這些研究的類型、對象及方法等不統(tǒng)一，研究結論也不完全一致。同時，為預防和降低FF，國內外各輔助生殖機構不斷探索，但對存在FF高危因素者所采取的受精方式、FF的補救條件及補救方法上目前仍存在差異，且各后續(xù)處理的安全性、有效性及經濟性也值得探討。因此，臨床及科研工作者亟須一個可靠的指導依據，以助患者取得更好的臨床結局。本文通過整理分析目前國內外與此相關的研究，綜述了影響FF的高危因素及為預防和降低FF采取的后續(xù)處理。以期為研究、預測及干預FF提供一定方向和依據，同時，為FF高危者找到有效、經濟及安全的實踐措施。

1 IVF 中受精失敗的高危因素

（1）男方因素：目前研究發(fā)現(xiàn)FF與男方因素最為相關，其中精液參數異常、精子與透明帶結合及穿透異常較常見，精子缺少與卵子質膜融合的相關受體或因子及精子原因導致的卵子激活障礙等較罕見[2,3]。Zhu J等[4]通過病因不同對IVF-ET周期進行分組，發(fā)現(xiàn)少弱精子癥組相較于精液參數正常組發(fā)生FF的比例明顯升高，Logistic回歸模型也顯示少弱精子癥是FF的獨立危險因素。孫青等[5]通過對比IVF-ET中正常受精率組(受精率≥50%)與低受精率組(受精率<50%)組的精子參數，發(fā)現(xiàn)精液常規(guī)中正常形態(tài)前向運動精子總數及處理后活動精子百分率與低受精率呈負相關，二者可作為預測IVF-ET低受精率的指標。薛林濤[6]對IVF-ET周期中精子參數與受精結局行多元回歸分析，結果顯示受精率與前向運動精子百分率及精子頂體完整率呈正相關，與精子DNA碎片率呈負相關，且三者均是預測IVF-ET周期受精失敗或低受精發(fā)生的獨立指標。同時Liu D等學者在顯微鏡下觀察未受精的卵母細胞，發(fā)現(xiàn)42%的卵子內未見精子穿過透明帶且精子的頂體反應較紊亂，說明精子與透明帶結合及穿透異常阻礙了受精發(fā)生[7]。這些研究從宏觀上揭示了精子形態(tài)及功能的異常可能導致FF的發(fā)生，但內在的分子機制仍不明確。有學者將IVF-ET中精液正常男性分為常規(guī)IVF-ET妊娠組及R-ICSI妊娠組，對比發(fā)現(xiàn)兩組間存在精漿蛋白及精子蛋白的表達差異且R-ICSI妊娠組的自發(fā)性頂體反應率增加，提示三者的改變可能影響IVF時的受精[8,9]，這將從分子的角度提升對原因不明男性不育的新認識。近期Yan Z等[10]發(fā)現(xiàn)，在14個FF或受精不良的獨立家系的原發(fā)不育男性中有5個出現(xiàn)了PLCZ1突變，對其進行人工卵母細胞激活（AOA）后其中4個被補救成功并產下3名健康嬰兒。我們已知PLCZ1在誘導細胞內鈣(Ca2+)振蕩和啟動卵母細胞激活中是必不可少的，這從分子基因的角度揭示了原發(fā)不育男性發(fā)生FF的原因，但仍需大規(guī)模的研究認證。

（2）女方因素：原發(fā)不孕及不明原因不孕是FF公認的高危因素，而卵母細胞結構、卵母細胞功能異常基本被認為與FF密切相關[2，3，4]。郝大勇等[11]通過對卵母細胞進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)IVFET中未受精的卵母細胞透明帶比受精的卵母細胞明顯增厚，這可能引起精子穿透過程的障礙而發(fā)生FF。Li J等[12]對既往ICSI受精失敗的卵母細胞均分成常規(guī)ICSI后行AOA組（AOA組）及常規(guī)ICSI組（非AOA組）受精，發(fā)現(xiàn)AOA組的受精率和可移植胚胎率明顯高于非AOA組，提示卵母細胞激活障礙與FF的發(fā)生密切相關。而Bonte D[13]等使用小鼠卵母細胞激活試驗(MOAT)來檢測精子相關的卵母細胞激活功能，再對比激活能力正常者的ICSI后FF的AOA周期和既往ICSI周期，發(fā)現(xiàn)AOA組的受精率、妊娠率和活產率明顯高于既往ICSI組，說明卵母細胞自身的激活缺陷與FF密切相關。由于AOA的過度侵入性，目前多在ICSI后發(fā)生FF時使用。近期，Huang L等[14]對出現(xiàn)卵母細胞成熟停滯的9個獨立家系的原發(fā)性不孕患者進行研究，發(fā)現(xiàn)其中4個為雙等位基因PATL2突變，提示原發(fā)不孕者出現(xiàn)卵母細胞成熟停滯可能與這一基因突變有關，這可能是原發(fā)不孕易發(fā)生FF的原因之一，但仍需大樣本的研究。

（3）其他因素：當然，IVF-ET過程中所涉及的一些不可控因素同樣會造成FF的發(fā)生，如操作技巧、實驗室環(huán)境、實驗室人員對卵子質量、卵子成熟程度及2PB排出情況的判斷等[2]，因此經驗豐富的胚胎學家對每一個輔助生殖實驗室都是至關重要的。

2 IVF-ET 中受精失敗的后續(xù)處理

（1）晚補救 ICSI（Late rescue intracytoplasmic sperm injection，L-ICSI）

1994年Lundin K[15]等首次報道用ICSI補救傳統(tǒng)IVF（過夜受精）后FF的卵母細胞，即晚補救ICSI，由于卵子最佳受精窗的錯失及卵子老化，受精率低于常規(guī)ICSI周期。由于L-ICSI相當于取卵后的第二日受精，導致第3天移植的往往是2-4細胞期胚胎，此時胚胎發(fā)育與子宮內膜發(fā)育不同步，雖受精率有所升高但胚胎種植率極低。因此，有學者將凍融移植和鮮胚移植周期做對比，發(fā)現(xiàn)相較于后者，前者胚胎植入率明顯改善，建議L-ICSI中的胚胎冷凍保存后用于凍融周期[16]。但因卵子老化、最佳受精窗口期的錯失及胚胎與子宮內膜發(fā)育的不同步，L-ICSI對FF周期的臨床結局并無明顯改善。

（2）部分卵胞漿內ICSI (half-ICSI)

1996年Aboulghar M等[17]提出對存在FF高危因素者應行half-ICSI受精，即將取出的卵母細胞隨機均分為2組，分別采用傳統(tǒng)IVF和ICSI授精。雖改善了此類患者的臨床結局，但盲目擴大了ICSI的應用范圍，并有部分卵子因未發(fā)現(xiàn)FF而未行補救ICSI造成了卵子的浪費。劉苡萱等[18]將IVF-ET中FF高危者分成Half-ICSI組與R-ICSI組，發(fā)現(xiàn)Half-ICSI組的ICSI周期率遠高于R-ICSI組，其89.8%的ICSI卵子是常規(guī)IVF中受精率正常的卵子，屬于過度ICSI。且ICSI時繞過了正常的受精過程，逃避了卵子對精子的自然選擇，存在將攜帶父源性異常染色體的精子注入卵子遺傳給子代的可能。Bonduelle M等[19]對ICSI獲得兒進行了產前檢測，發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常率明顯高于一般人群，且主要為父源性，當存在精液異常時發(fā)病率更高，因此應盡量避免過度ICSI。

（3）短時受精聯(lián)合早期補救ICSI (Rescue-ICSI， R-ICSI)

2003年Chen等[20]提出了R-ICSI的概念，即IVF受精4-6h通過觀察2PB的排出情況判斷是否受精，對無2PB排出的卵母細胞行補救ICSI，獲得了較高的受精率、妊娠率和著床率。He Y等將存在受精失敗高危因素的IVF周期分為傳統(tǒng)IVF組、短時IVF受精組（受精率>30%）及R-ICSI組（TFF后行R-ICSI)，發(fā)現(xiàn)三組間胚胎植入率和臨床妊娠率無明顯差異，說明 R-ICSI是一種安全、可靠的受精方式，使FF高危者即使發(fā)生FF時仍獲得了較好的臨床結局[21]。即使對目前爭議較大的不明原因性不孕，嚴為巧等采用Half-ICSI及 R-ICSI受精，對比發(fā)現(xiàn)二者在正常受精率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率及種植率等方面均無統(tǒng)計學差異[22]。當然，也有研究者稱當一個周期獲得的卵母細胞較少且精子參數正常時，傳統(tǒng)IVF的結局優(yōu)于補救ICSI和ICSI周期[23]。因此R-ICSI受精是否適用于所有的IVF-ET周期仍是不明確的。

L-ICSI因不理想的臨床結局，目前臨床上已基本棄用。對FF高危者，相較于half-ICSI， R-ICSI既提高了IVF-ET中FF周期的正常受精率，又避免了過度ICSI帶來的安全隱患，對預防和改善FF更加精準、有效。

3 R-ICSI 的依據及其優(yōu)勢

3.1 R-ICSI 的理論依據

R-ICSI包括短時受精及早期補救ICSI兩部分。傳統(tǒng)IVF受精失敗后的補救ICSI大多在隔日進行，即L-ICSI，隨卵齡的延長細胞核質過度成熟甚至老化，導致卵子最佳受精窗的錯失，且卵母細胞暴露于培養(yǎng)液內增加了與毒性物質接觸的時間，導致遺傳物質畸變及染色體異常的概率升高，不僅影響卵子受精而且降低了胚胎發(fā)育潛能，這為R-ICSI奠定了基礎。

3.2 短時受精中受精的觀察時機及指標

核質成熟的卵母細胞停留在MⅡ期，與精子結合后被激活完成第二次減數分裂并排出2PB，隨后再形成雌雄原核，因此，2PB的排出是卵母細胞形態(tài)學上最早的受精的標志，是目前判斷卵母細胞早期受精的金標準，因此找到2PB的最佳觀測時間，以便及時對未受精的卵子行補救ICSI非常重要。有研究表明[24]，卵子一般在精卵共培養(yǎng)2-4h后完成受精過程，6h后大約有90%的受精卵排出第二極體，也有報道發(fā)現(xiàn)授精4h超過90%的受精卵排出第二極體[25]。當然，即使授精6 h后仍存在10%左右的卵母細胞出現(xiàn)2PB延遲釋放的情況，因此對FF周期行補救ICSI時對存在2PB的卵不建議行ICSI，防止造成多精受精。近期有研究者通過紡錘體觀察儀觀察IVF中不同受精時間（4h、5h、6h）的卵母細胞，發(fā)現(xiàn)受精5小時出現(xiàn)紡錘體是卵母細胞未受精的準確指標，此時結合補救ICSI可有效地防止FF及降低多精受精率[26]。但由于PM價格昂貴，目前并不是每個生殖實驗室的常規(guī)用品。

3.3 早期補救ICSI 的時間

卵母細胞成熟包括細胞核、質的共成熟，且細胞質成熟需經歷復雜的生理生化過程，較細胞核成熟晚，二者同時成熟對受精及后續(xù)的胚胎發(fā)育至關重要與此同時，在脫顆粒細胞判斷是否受精之前，卵子周圍的顆粒細胞可為卵母細胞提供促進早期胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)物質，而適時的脫除顆粒細胞又可去除對早期胚胎發(fā)育有害的物質，并避免顆粒細胞和高密度精子長期存在對胚胎發(fā)育的不利影響。王紫娟等研究者[27]發(fā)現(xiàn)R-ICSI的受精率并不明顯低于常規(guī)IVF或首次因男方因素行ICSI的周期，推測可能是因其縮短了精卵共孵育時間的同時，穿刺時間又較常規(guī)ICSI周期晚，此時卵母細胞不僅更成熟，且汲取了更多養(yǎng)分并適時脫離了不利因素，從而更利于受精成功。精卵共孵育4-6小時通過觀察2PB判斷受精是R-ICSI的第一步，找到行補救ICSI的最佳時機是其第二步的關鍵，既能讓卵子仍處于最佳的受精窗口期又使得到的胚胎與子宮內膜可以實現(xiàn)同步化。因此，有學者對補救ICSI時的受精時間進行分組(<6h、6-8h和>8h)，發(fā)現(xiàn)臨床轉歸與補救時間呈負相關[28]，補救時間越早臨床結局越好。隨后，林碎玲等[29]又將補救時間間隔分為(4-5 h、5.1-6 和6.1-8 h )，同樣發(fā)現(xiàn)補救時間越早胚胎質量及妊娠結局越好。綜上所述，結合2PB的排出時間，受精4-6h后拆顆粒對受精失敗的卵母細胞立即行補救ICSI仍是目前大多數生殖中心較好的選擇。

3.4 R-ICSI 的條件

目前，有些輔助生殖機構對受精率低于50%的未受精卵子行R-ICSI[27]，但有學者稱在受精能力較好時，卵丘細胞的早期脫去和補救ICSI將顯著增加多原核率[30]。因此，有研究者將受精率<50%行R-ICSI處理的周期分成三組（0%、<25%、>25%)，其受精率分別為74.66%、68.35%和65.46%，多倍體率分別為8.55%、11.33%和14.47%，且第2組可移植胚胎率為38.33%，高于其他兩組，發(fā)現(xiàn)對受精率<25%的組行補救ICSI可明顯提高受精率及優(yōu)胚率，對受精率>25%組行補救ICSI風險高臨床回報低[31]。

3.5 R-ICSI 的安全性

R-ICSI廣泛應用的同時，有學者對其安全性表示了擔憂，譚艷等[32]的Meta分析結果顯示R-ICSI與常規(guī)IVF及常規(guī)ICSI相比，新生兒的各項出生結局并無統(tǒng)計學差異，也有學者發(fā)現(xiàn)R-ICSI與常規(guī)IVF和ICSI相比，在保證分娩健康兒童之外其臨床妊娠率也相似[33]。綜上所述，對存在FF高風險的周期，采用R-ICSI受精將是安全、經濟及有效的。但由于研究對象的時間限制，其長遠影響仍需繼續(xù)研究。

4 小結與展望

IVF中影響FF的高危因素是眾多的，如精子參數異常，尤其是邊緣性合格精液及原發(fā)性不孕等。眾所周知，大多數FF與男性因素密切相關，為防止FF高危者發(fā)生FF，尤其是合并精液參數異常者，R-ICSI應為目前最佳的受精方式，即精卵共孵育4-6 h，通過觀察2PB的排出情況判斷是否受精，當受精率<25%時立即行補救ICSI。當然找到觀察2PB（或其他受精指標）與補救ICSI時機的最佳平衡點及最佳的補救條件，將使患者得到更好的臨床結局。目前國內外對FF高危因素及后續(xù)處理的研究多為回顧性研究且樣本量有限，而回顧性研究本身具有一定的局限性，不能控制研究對象的分布，如年齡這類明顯影響受精及胚胎發(fā)育的干擾因素，故存在一定的偏倚，需結合受精生物學理論和臨床實踐。因此，大樣本、設計精良、具有所有最新技術優(yōu)勢的前瞻性隨機對照試驗研究亟須完善。