大蒜素預處理對急性心肌梗死模型大鼠心肌病理改變的影響

方 燕 鄭旭旭 李麗燕

急性心肌梗死（acute myocadical infraction，AMI）屬于急性冠脈綜合征的嚴重類型，是心源性猝死的主要原因[1]。近年來隨著高血壓、高血脂等基礎疾病患病人群的增加，AMI 發病率呈逐年上升且年輕化趨勢[2]，具有起病急、進展快的特點，有效預防AMI 對高危人群具有重要意義。大蒜素是三硫代烯丙醚類化合物，天然存在于百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，既往研究發現，大蒜素具有抑制心肌缺血再灌注大鼠心律失常、抑制糖尿病大鼠心肌組織纖維化的作用[3-4]。本實驗以臨床治療AMI 一線用藥維拉帕米做為陽性對照，探討大蒜素預處理對AMI 模型大鼠心肌病理改變的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 180 只無特定病原微生物級健康成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，動物質量合格證號：201911007，體質量（230±20）g，購自溫州醫科大學實驗動物中心[SYXK（浙）2016-0006]，清潔環境適應性飼養1 周，環境條件設置：12h 光照黑暗交替、溫度（25±1）℃、相對濕度（65±5）%。本實驗通過浙江省溫州市中醫院倫理委員會審核，倫理審批號：WZLL[K]字2019-032。數字編碼180 只大鼠，根據隨機數字表法分為假手術組、AMI 組、維拉帕米2.5 mg·kg-1·d-1預處理組和大蒜素5、10、20mg·kg-1·d-1預處理組（給藥劑量根據實驗動物與人等效劑量換算公式計算[5]），每組30 只。

1.2 主要藥物與試劑 大蒜素注射液（徐州萊恩藥業有限公司，規格2mL:30mg，批號20181006）；鹽酸維拉帕米注射液（上海禾豐制藥有限公司，規格2mL:5mg，批號20190130）；硝基藍四氮唑（nitroblue tetrazolium，NBT，上海前進試劑廠，批號190327）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）、原位末端轉移酶標記技術（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司，批號20190517、20190605）。

1.3 主要儀器 動物心電圖機（上海精密科學儀器有限公司，型號：BL-A420）；動物呼吸機（上海精密科學儀器有限公司，型號：ALC-V8）；小動物超聲儀（加拿大Visual Sonics 公司，型號：Vevo2100）；石蠟組織切片機（德國Leica 公司，型號：RM2125）；圖像分析系統（北京麥克奧迪儀器儀表有限公司，型號：Image-Pro Plus 6.0）；熒光顯微鏡（日本Nikon 公司，型號：TE2000-M）；超薄切片機（瑞典LKB 公司，型號：LKB-Ⅲ）；透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司，型號：H-7650）；倒置光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：AI09）。

1.4 實驗方法

1.4.1 給藥預處理與模型制備 給藥預處理[6]：加入適量生理鹽水制備濃度為2.5、5、10mg/mL 的大蒜素溶液和濃度為1.25mg/mL 的維拉帕米溶液；大蒜素5、10、20mg·kg-1·d-1預處理組予濃度為2.5、5、10mg/mL的大蒜素溶液，維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預處理組予濃度為1.25mg/mL 的維拉帕米溶液，假手術組和AMI 組予生理鹽水；各組均于造模手術前7 天開始腹腔注射給藥，給藥容積2mg·kg-1·d-1，1 天1 次。模型制備[7]：各組大鼠實施麻醉后，仰位固定、連接二導聯心電圖（BL-A420 型動物心電圖機，上海精密科學儀器有限公司）實時監測，氣管切開并連接動物呼吸機（ALC-V8 型，上海精密科學儀器有限公司，參數設置：頻率90 次/min、潮氣量10mg/kg），采用0 號手術縫合線于左第3、4 肋間開胸暴露心臟，于左心耳下2～3mm 處結扎左冠狀動脈前降支；造模成功判斷標準[8]：結扎部位心肌蒼白或發紺、心電圖示ST 段弓背持續抬高、T 波高聳。假手術組行手術通路但不結扎。造模手術24h 后行各指標檢測。

1.4.2 心功能指標檢測 每組大鼠隨機取10 只，通過小動物超聲儀（Vevo2100 型，加拿大Visual Sonics公司）取左室乳頭肌水平短軸切面，檢測舒張末期左室內徑（left ventricμLar end-diastolic diameter，LVIDd）、收縮末期左室內徑（left ventricμLar diameter at the end of systole，LVIDs）、射血分數（ejection fraction，EF）和每搏輸出量（stroke volume，SV），每只動物均連續測量3 個心動周期，取平均值。

1.4.3 心臟指數和心肌梗死體積百分比計算 （1）取上述心功能指標檢測后各組10 只大鼠，稱量體質量（W體），頸椎脫臼處死后迅速開胸取心臟、生理鹽水沖洗干凈后稱重（W心），心臟指數=（W心/W體）。（2）稱重后心臟組織置-20℃冰箱凍存30min，取左心室沿平行于房室溝方向橫切為4～5 片（MICROM HM340E 型病理組織切片機，德國美康公司），于37℃濃度2%的NBT 溶液中孵育1h，每5min 翻動心肌切片1 次使著色均勻。通過Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統（北京麥克奧迪儀器儀表有限公司）測算心肌梗死體積百分比（缺血區呈蒼白色、正常區呈紫黑色），心肌梗死體積百分比（%）=（心肌梗死面積×切片厚度/總心肌體積）×100%。

1.4.4 心肌組織病理學檢查及損傷評分 每組大鼠隨機取10 只，頸椎脫臼處死后迅速開胸取心臟，切取左心室心肌置4%多聚甲醛溶液固定72h，依次行脫水、浸蠟包埋、5μm 厚度切片（RM2125 型石蠟切片機，德國Leica 公司）、脫蠟水化后，行HE 染色（蘇木素溶液染色10min、伊紅水溶液染色3min、1%鹽酸酒精分化3s），脫水和透明處理后中性樹膠封片，通過倒置光學顯微鏡觀察心肌組織病理學改變；損傷評分[9]：正常心肌計0 分，呈病灶型病變且病變視野比例＜1/4 計1 分，呈病灶型病變且病變視野比例為1/4～1/2 計2 分，呈彌漫性病變且病變視野比例＞1/2 計3 分，分別從變性壞死、出血、間質水腫、中性粒細胞浸潤四方面計分后求和即為損傷評分。

1.4.5 細胞凋亡觀察及凋亡指數（apoptosis index，AI）計算 取1.4.3 制備的左心室心肌組織切片并脫蠟水化處理后，按照TUNEL 試劑盒說明書逐步進行操作，37℃避光孵育1h 并洗滌后，用5μg/mL 濃度的DAPI 溶液染色5min 使細胞核著色，洗滌后用50%甘油封片，通過熒光顯微鏡（TE2000-M 型，日本Nikon 公司）觀察并拍照（凋亡細胞核著綠色）；AI 計算：每張切片隨機取5 個不重疊視野分別計數凋亡細胞數和細胞總數，取平均值，AI（%）=（凋亡細胞數/細胞總數）×100%。

1.4.6 心肌細胞超微結構觀察 取各組剩余10 只大鼠，頸椎脫臼處死后迅速開胸取心臟，切取左心室5mm 厚心肌組織，置4℃濃度4%的戊二醛溶液中固定24h 后PBS 溶液浸泡洗滌3 次（30min/次），置4℃濃度1%鋨酸固定3h 后雙蒸水浸泡洗滌3 次（10min/次），梯度酒精和無水丙酮脫水、氧化丙烯置換、Epon812 環氧樹脂浸透包埋后，經半薄切片定位，以70～90nm 厚度超薄切片（LKB-Ⅲ型超薄切片機，瑞典），通過醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重電子染色后使用透射電子顯微鏡（H-7650 型，日本Hitachi 公司）觀察細胞超微結構并拍照。

1.5 統計學方法 應用SPSS 15.0 統計軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（） 表示，多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t 檢驗，檢驗水準取α=0.05，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大蒜素預處理對AMI 模型大鼠心功能指標的影響 與假手術組比較，AMI 組大鼠LVIDd、LVIDs升高且EF、SV 降低，差異有統計學意義（P 均＜0.01）；經大蒜素10、20mg·kg-1·d-1或維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預處理7 天能夠有效抑制LVIDd、LVIDs 升高及EF、SV 降低，與AMI 組比較差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）；與維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預處理組比較，大蒜素20mg·kg-1·d-1預處理組對LVIDs 升高和SV 降低的抑制作用更優（P＜0.05）。見表1。

表1 大蒜素預處理對AMI 模型大鼠心功能指標的影響（）

表1 大蒜素預處理對AMI 模型大鼠心功能指標的影響（）

注：AMI 為急性心肌梗死；LVIDd 為舒張末期左室內徑；LVIDs 為收縮末期左室內徑；EF 為射血分數；SV 為每搏輸出量；與假手術組比較，aP＜0.01；與AMI 組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1 預處理組比較，cP＜0.05

表2 大蒜素預處理對AMI 模型大鼠心臟指數、心肌梗死體積百分比、損傷評分和AI 的影響（）

表2 大蒜素預處理對AMI 模型大鼠心臟指數、心肌梗死體積百分比、損傷評分和AI 的影響（）

注：AMI 為急性心肌梗死；AI 為凋亡指數；與假手術組比較，aP＜0.01；與AMI 組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1 預處理組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01

2.2 大蒜素預處理對AMI 模型大鼠心臟指數和心肌梗死體積的影響 與假手術組比較，AMI 組大鼠心臟指數和心肌梗死體積百分比均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；經大蒜素10、20mg·kg-1·d-1或維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預處理7 天能有效抑制心臟指數和心肌梗死體積百分比升高，與AMI 組比較差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）；與維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預處理組比較，大蒜素20mg·kg-1·d-1預處理組對心肌梗死體積百分比升高的抑制作用更優（P＜0.01）、兩組間心臟指數比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見插頁圖1 和表2。

圖1 各組大鼠心肌組織梗死狀況（NBT 染色，蒼白色為梗死區）

2.3 大蒜素預處理對AMI 模型大鼠心肌組織病理改變和損傷評分的影響 經HE 染色后觀察，假手術組大鼠心肌組織結構完整、心肌纖維條路清晰，細胞排列整齊規則、形態正常；AMI 組大鼠呈現心肌纖維腫脹、斷裂、條路紊亂無序，心肌細胞排列不規則、核固縮偏移，可見大量中性粒細胞浸潤；與AMI 組比較，經大蒜素5、10、20mg·kg-1·d-1或維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預處理7 天能夠不同程度抑制上述病理性形態結構改變，其中大蒜素20mg·kg-1·d-1預處理組效果更優。與假手術組比較，AMI 組大鼠心肌組織損傷評分升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；經大蒜素10、20mg·kg-1·d-1或維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預處理7 天能夠有效抑制心肌組織損傷評分升高，與AMI 組比較差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）；與維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預處理組比較，大蒜素20mg·kg-1·d-1預處理組對心肌組織損傷評分升高的抑制作用更優（P＜0.05）。見插頁圖2 和表2。

圖2 大蒜素預處理對AMI 模型大鼠心肌組織病理改變的影響（HE，×200）

2.4 大蒜素預處理對AMI 模型大鼠心肌細胞凋亡的影響 經TUNEL 染色后觀察，假手術組大鼠心肌組織僅可見極少量凋亡細胞；與假手術組比較，AMI組大鼠心肌組織凋亡細胞數量明顯增多，AI 顯著升高（P＜0.01）；經大蒜素5、10、20mg·kg-1·d-1或維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預處理7 天能夠不同程度抑制AMI 大鼠心肌細胞凋亡數量增多和AI 升高，與AMI組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；與維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預處理組比較，大蒜素20mg·kg-1·d-1預處理組對心肌細胞凋亡的抑制作用更優（P＜0.01）。見插頁圖3 和表2。

圖3 大蒜素預處理對AMI 模型大鼠心肌細胞凋亡的影響（TUNEL，×200）

2.5 大蒜素預處理對AMI 模型大鼠超微結構改變的影響 經透射電子顯微鏡觀察，假手術組大鼠心肌細胞超微結構未見異常；AMI 組呈現胞膜破裂、碎片，肌絲溶解斷裂，線粒體數量減少、腫脹、嵴斷裂溶解，核膜破裂、核仁邊界不清等超微結構病變；經大蒜素5、10、20mg·kg-1·d-1或維拉帕米2.5mg·kg-1·d-1預處理7 天能夠不同程度抑制上述病理性超微結構改變，其中大蒜素20mg·kg-1·d-1預處理組效果較優。見插頁圖4。

圖4 大蒜素預處理對AMI 模型大鼠超微結構改變的影響（TEM，×10000）

3 討論

AMI 是臨床較為常見的急危重癥，多由動脈粥樣硬化狹窄、斑塊脫落聚集形成血栓所致，引發心源性休克、惡性心律失常等而致死[10]，AMI 起病急、進展快，死亡多發生在發病1～2h 以內，部分患者無法在最佳治療窗內得到有效救治[11]。所以，研究能夠有效抑制AMI 后心肌組織損傷的藥物，對AMI 患病高危人群具有重要意義。

大蒜素是百合科蔥屬植物大蒜鱗莖的主要活性物質，藥理研究發現，大蒜素具有保護心血管系統、擴張血管、改善血液循環等作用[12]，本實驗結果顯示，經大蒜素預處理能夠有效抑制AMI 模型大鼠LVIDd、LVIDs 升高和EF、SV 降低，并且大蒜素20mg·kg-1·d-1預處理對LVIDs 升高和SV 降低的抑制作用優于維拉帕米，提示大蒜素預處理具有抑制大鼠AMI 后心功能降低的作用。

NBT 是一種水溶性的光敏感復合物，水溶液呈淡黃色，能夠被正常心肌組織中的脫氫酶催化還原生成紫黑色的甲臢顆粒、沉積于胞漿中，而梗死區心肌組織內缺少脫氫酶而不能染色，因此NBT 可用于心肌組織梗死的檢測。本實驗NBT 染色結果顯示，AMI 模型大鼠左心室可見明顯梗死灶，與王佳等[13]研究結果一致；計算心臟指數發現AMI 模型大鼠心臟變大，與陳恒文等[14]研究結果一致；經大蒜素預處理能夠有效抑制AMI 模型大鼠心肌梗死體積百分比和心臟指數升高，并且大蒜素20mg·kg-1·d-1預處理對心肌梗死體積百分比和心臟指數升高的抑制作用優于維拉帕米，提示大蒜素預處理具有抑制AMI 模型大鼠心肌組織壞死的作用。

通過HE 染色對心肌組織行病理學檢查，發現AMI 模型大鼠缺血區心肌組織呈現心肌纖維腫脹、斷裂，心肌細胞排列不規則、核固縮偏移，大量中性粒細胞浸潤等病理性形態結構改變，與施洋等[15]研究結果一致；通過TUNEL 染色法觀察心肌細胞凋亡，發現AMI 模型大鼠缺血區心肌細胞凋亡數量明顯增多，與張杰等[16]研究結果一致；通過TEM 觀察細胞超微結構，發現AMI 大鼠呈現胞膜破裂，肌絲溶解斷裂，線粒體數量減少、腫脹、嵴斷裂溶解，核膜破裂、核仁邊界不清等超微結構病變，與張麗萍[17]研究結果一致。經大蒜素預處理能夠明顯抑制AMI 大鼠心肌組織病理學改變并抑制損傷評分升高，抑制心肌細胞凋亡及AI 升高，抑制心肌細胞超微結構改變，并且大蒜素20mg·kg-1·d-1預處理組的上述作用優于維拉帕米，提示大蒜素預處理具有抑制AMI 后心肌組織病理改變的作用。

綜上所述，大蒜素預處理對AMI 模型大鼠心肌組織病理改變、心肌細胞超微結構病理改變和心功能具有保護作用。