血清miR-29b、miR-126 與老年糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性分析

戴林雄 何 斐 泮瑛瑛 張 偉 應(yīng) 巧

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是導(dǎo)致患者失明的主要原因[1]。我國(guó)DR 的患病率為24.7%～37.5%，其具體發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚，給患者身心健康和生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響[2]。尋找DR 致盲相關(guān)標(biāo)志物對(duì)DR 診治具有重要意義。微小核糖核酸（miRNA）作為一種高度保守的短小RNA，在細(xì)胞增殖、凋亡，腫瘤發(fā)生、免疫反應(yīng)及血管新生等多種生物學(xué)行為中有重要作用[3-4]。本研究擬檢測(cè)老年DR 患者血清miR-29b、miR-126 水平，探討血清miR-29b、miR-126 水平異常與老年DR 發(fā)病及進(jìn)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院2017 年5 月—2019 年11 月收治的老年DR 患者126 例作為研究對(duì)象。依據(jù)2002 年國(guó)際糖尿病性視網(wǎng)膜病變分期標(biāo)準(zhǔn)[5]對(duì)DR 患者分期，將單純2 型糖尿病患者納入DM 組（42 例），非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變作為NPDR 組（40 例），增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)镻DR 組（44 例），同時(shí)，選取40 名年齡≥60 歲的老年體檢者作為對(duì)照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過（批準(zhǔn)編號(hào)：倫審-2017-0039）。受試者均簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）糖尿病患者均符合《中國(guó)2 型糖尿病防治指南（2017 年版）》中2 型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；（2）經(jīng)裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡和眼底血管造影檢查確診為DR；（3）年齡≥60 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有微血管異常者；（2）臨床資料不詳細(xì)；（3）惡性腫瘤及其他眼內(nèi)疾病者。

1.3 試劑及儀器 Trizol 總RNA 提取試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)15596018）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒（生工生物工程上海股份有限公司，批號(hào)B532435-0020、B532461-0001）；紫外分光光度計(jì)（美國(guó)HACH 公司，型號(hào)：DR6000 型）；熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司，型號(hào)：7500 型）；血糖儀（德國(guó)羅氏診斷有限公司，型號(hào)：Accu-Chek Active）。

1.4 指標(biāo)測(cè)定 （1）測(cè)靜息狀態(tài)下右臂肱動(dòng)脈收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）；（2）早晨空腹抽取受試者外周靜脈血15mL，測(cè)定糖化血紅蛋白（HbA1c）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等指標(biāo)；（3）另抽取兩管5mL 靜脈血于EDTA 抗凝管中，離心后分離血清備檢。利用Trizol 總RNA 提取試劑盒提取血清總RNA，紫外分光光度計(jì)檢查樣品RNA 濃度，取A260/A280≥1.80 樣品完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（按Qiagenmi Script Reverse Transcripition Kie 說明書進(jìn)行）。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用定量PCR 試劑盒以及miR-29b 和miR-126與管家基因U6 為內(nèi)參的特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 檢查（miRNA-29b 上游引物5'-UAGCAUCACAGAAAUAUUGGC-3'，miRNA-29b 下游引物5'-CAAUAUUUCUGUGCUGCUAUU-3'；miRNA-126 上游引物5'-UGAGAACUGUAUUCCAUGGGUU-3'，miRNA-126 下游引物5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGUGUU-3'；U6 上游引物5'-GCCAAGGCTGTGGGCAAGGTAT-3'，U6 下游引物5'-TCTCCAGGCGGCACGCAGAATG-3'。以上引物由上海豐壽實(shí)業(yè)有限公司合成），所有反應(yīng)均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件為95℃15min、94℃ 15s、58℃ 30s、70℃ 30s，30 個(gè)循環(huán)。采用實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行檢測(cè)，以U6 為內(nèi)參照，使用2-ΔΔCT 法計(jì)算miRNA-29b 和miRNA-126 相對(duì)表達(dá)量。（4）使用血糖儀測(cè)量患者空腹血糖（FBG）及餐后2h 血糖（2hPG）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，采用單因素方差分析比較不同組血清miR-29b、miR-126、FBG、2hPG、HbA1c，多重比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)的采用率和構(gòu)成比描述；采用二分類Logistic 逐步回歸分析探討老年糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的影響因素，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組研究對(duì)象一般資料比較 四組研究對(duì)象的性別、年齡及BMI 比較均無明顯差異（P＞0.05），NPDR 組和PDR 組糖尿病病程明顯大于DM 組，PDR 組糖尿病病程明顯大于NPDR 組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組研究對(duì)象一般資料比較（）

表1 各組研究對(duì)象一般資料比較（）

注：對(duì)照組為老年體檢者；DM 組為單純2 型糖尿病患者；NPDR 組為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者；PDR 組為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者；BMI 為體質(zhì)指數(shù)；“-”為無比項(xiàng)數(shù)據(jù)；與DM 組比較，aP＜0.05；與NPDR 組比較，bP＜0.05

2.2 四組生化指標(biāo)比較 四組血清miR-29b 和miR-126 水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中PDR 組血清miR-29b 水平明顯高于對(duì)照組、DM組及NPDR 組（P 均＜0.01），miR-126 水平明顯低于對(duì)照組、DM 組及NPDR 組（P 均＜0.01）；NPDR 組血清miR-29b 明顯高于DM 組和對(duì)照組（P＜0.05），miR-126 明顯低于DM 組和對(duì)照組（P＜0.05）；NPDR組及PDR 組SBP、DBP 明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），NPDR 組、PDR 組及DM 組FBG、2hPG、HbA1c、TG、TC、HDL-C 水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），PDR 組FBG、2hPG、HbA1c、TG 水平明顯高于DM 組（P＜0.05）。見表2。

2.3 影響糖尿病患者視網(wǎng)膜病變單因素分析 DR患者年齡、糖尿病病程、血清miR-29b、miR-126、HbA1c、FBG 等因素具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 影響糖尿病視網(wǎng)膜病變的多因素分析 以視網(wǎng)膜病變?yōu)橐蜃兞浚o=0、有=1），以表3 中有意義的變量為自變量進(jìn)行二分類Logistic 逐步回歸分析，結(jié)果顯示，年齡＜75 歲、血清miR-126≥2.43ng/μL 為老年糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的保護(hù)因素，糖尿病病程≥7.00 年、血清miR-29b≥8.38ng/μL、HbA1c≥6.00%、FBG≥8.15mmol/L 為老年糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的危險(xiǎn)因素。見表4。

3 討論

DR 是一種具有特異性改變的眼底病變，最主要的病理特征是視網(wǎng)膜微血管出現(xiàn)功能障礙[7]。DR 是糖尿病患者的常見并發(fā)癥，占比高達(dá)40.3%[8]，目前研究認(rèn)為DR 的發(fā)病是由多種因素綜合作用的結(jié)果，主要包括高血糖、代謝異常、蛋白質(zhì)非酶促糖基化、血流動(dòng)力學(xué)障礙、氧自由基形成、凝血機(jī)制異常及血管增生因子等因素。既往有研究顯示，視網(wǎng)膜早發(fā)性小膠質(zhì)細(xì)胞活化、白細(xì)胞介素-18 mRNA 及其蛋白表達(dá)增加，表明視網(wǎng)膜病可能是由調(diào)控新生血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移與定位的基因促使[8-9]。

miRNA 不僅對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡具有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)在干細(xì)胞的分化過程中也發(fā)揮重要作用。DR 的發(fā)生發(fā)展需要細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，miRNA 也介導(dǎo)參與了DR 發(fā)生發(fā)展過程[10-11]。血清miR-29b 是微小RNA-29 家族（microRNA-29）成員之一，其通過miR-29 家族在酸性富含半胱氨酸分泌型蛋白、層黏連蛋白及I、Ⅳ型膠原蛋白等是DR 上起重要作用[12]。miR-126 作為miRNA 重要類型，定位于表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域7（EGFL7）基因3′UTR 內(nèi)含6、7，可影響EGFL7 對(duì)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)與定位的調(diào)控功能[13]。研究表明，上調(diào)miR-126 表達(dá)可促進(jìn)血管新生，并可維持血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定及完整性；亦有研究指出，miR-126 可通過降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平而影響內(nèi)皮細(xì)胞功能[14-15]。

表2 各組生化指標(biāo)比較（）

表2 各組生化指標(biāo)比較（）

注：對(duì)照組為老年體檢者；DM 組為單純2 型糖尿病患者；NPDR 組為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者；PDR 組為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者；SBP 為收縮壓；DBP 為舒張壓；FBG 為空腹血糖；2hPG 為餐后2h 血糖；HbA1c 為糖化血紅蛋白；TG 為三酰甘油；TC 為總膽固醇；HDL-C 為高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C 為低密度脂蛋白膽固醇；miR-29b 為微小核糖核酸-29b；miR-126 為微小核糖核酸-126；1mmHg=0.133kPa；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與DM 組比較，bP＜0.05；與NPDR 組比較，cP＜0.05

表3 影響糖尿病患者視網(wǎng)膜病變單因素分析[n（%）]

表3 影響糖尿病患者視網(wǎng)膜病變單因素分析[n（%）]（續(xù)）

表4 老年糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的影響因素Logistic 回歸分析

本研究結(jié)果顯示，PDR 組血清miR-29b 水平明顯高于對(duì)照組、DM 組及NPDR 組（P＜0.01），miR-126水平明顯低于對(duì)照組、DM 組或NPDR 組（P＜0.05）；NPDR 組血清miR-29b 明顯高于DM 組和對(duì)照組（P＜0.05），miR-126 明顯低于DM 組和對(duì)照組（P＜0.05 ）；表明血清miR-29b 水平隨病情加重而升高，與DR 患者的總體生存率獨(dú)立相關(guān)，DR 患者血清miR-29b 表達(dá)水平與DR 發(fā)病、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，也在DR 發(fā)病中發(fā)揮重要作用，DR 患者血清高表達(dá)的miR-29b 可能通過促進(jìn)視網(wǎng)膜血管生成而促進(jìn)發(fā)病及病程進(jìn)展；此外血清miR126 水平在DR 患者明顯降低，可能參與DR 發(fā)病過程，表明miR126可較好地判別糖尿病患者發(fā)生DR，可能成為早期發(fā)現(xiàn)糖尿病患者發(fā)生DR 的血液指標(biāo)。多因素Logistic逐步回歸分析探討DR 患者的危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示，患者年齡＜75 歲、血清miR-126≥2.43ng/μL 為老年糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的保護(hù)因素，糖尿病病程≥7.00 年，血清miR-29b≥8.38ng/μL、HbA1c≥6.00%、FBG≥8.15mmol/L 為老年患者糖尿病視網(wǎng)膜病變的危險(xiǎn)因素，可能是因?yàn)椴〕淘介L(zhǎng)，機(jī)體各項(xiàng)功能減退越嚴(yán)重，代謝能力隨之降低，易導(dǎo)致血管病變發(fā)生，從而對(duì)視網(wǎng)膜病變起到一定的推動(dòng)作用，同時(shí)提示血清miR-29b、miR-126 與DR 發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，老年DR 患者血清miR-29b 水平升高，miR-126 水平降低，二者可能成為早期發(fā)現(xiàn)DR的血清生物標(biāo)志物。