牡荊苷對急性腦缺血大鼠大腦紋狀皮質nNOS免疫表達的影響

劉 磊 吳一飛

(陜西中醫藥大學基礎醫學院，咸陽 712046)

急性腦缺血是臨床常見的腦血管疾病，可導致相應神經元損害引發神經功能障礙[1]。研究發現，急性腦缺血實驗大鼠腦皮層紋狀區可在受到缺血缺氧性信息刺激后激活神經元一氧化氮合酶(nNOS)的表達，經免疫組化檢測發現nNOS陽性神經元顯著增多，且對維持炎性反應的發展、誘發并加重皮層紋狀區神經元損傷具有至關重要的作用[2]。另有研究報道，急性腦缺血實驗大鼠造模24 h后大腦皮層紋狀體脫失明顯，nNOS陽性神經元顯著增多，其中大腦皮層紋狀體是nNOS的主要來源，可損傷神經細胞，誘發膠質細胞壞死[3]。故在急性腦缺血治療中應積極控制大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元的數量和活性。牡荊苷是從牡荊葉和牡荊子中提取的黃酮類化合物，在既往的報道中證實牡荊苷對急性腦缺血大鼠具有抗氧化應激活性和腦保護作用[4，5]。牡荊苷是否能夠調控急性腦缺血大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元的數量和表達，以減少神經元細胞凋亡尚鮮有報道。本研究選取50只雄性SD大鼠開展實驗，報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 50只SD雄性大鼠，SPF級，6～8周，體質量180～220 g，均購自西安交通大學醫學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK(陜)-2018001。

1.1.2試劑與儀器 牡荊苷(上海經科化學科技有限公司，純度HPLC≥98%)；2%戊巴比妥鈉(諾華制藥有限公司)；磷酸鹽緩沖液(武漢博士德生物公司)；4%多聚甲醛溶液(北京雷根生物技術有限公司)；2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液、兔抗鼠nNOS、β-actin，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(美國Sigma 公司)；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法(TUNEL)試劑盒(艾美捷科技有限公司)；TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)。

EG1150型石蠟包埋機、RM2235型組織切片機(德國Leica 公司)；BX53型光學顯微鏡(日本Olympus 公司)；905型恒溫冰箱(美國Thermo 公司)；7500型熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀(美國Axygen公司)；50W-X8型轉膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1分組和建模方法 將50只大鼠隨機分為假手術組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各10只，除假手術組外均采用線栓左側大腦中動脈法建立急性腦缺血模型，具體操作：采用改良Longa法造模，選用白色日本尼龍魚線(直徑 0.23 mm)，在插入端蘸聚酯成光滑紡錘狀，在距離插入端大約18 mm的位置進行標記[6]。取40 mg/kg 2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹腔麻醉，于頸部做正中切口，將左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈分離并暴露，對頸外動脈分支電凝，結扎并游離其主干遠端。自頸外動脈殘端起始部位將拴線插入，插入深入距離頸總動脈分叉處大約為17.5～18.5 mm，若遇到阻力則停止操作，將拴線固定并結扎縫合。假手術組操作過程同上，但不結扎栓線。大鼠清醒后，將同時具有以下3項者即為建模成功：①左側Horner征，即眼裂變小、眼球下陷；②爬行時向右側劃圈且步態不穩；③提尾時右前肢內收屈曲，向右上方旋轉。

1.2.2干預方法 確認建模成功后模型組和牡荊苷劑量組均立即予以干預，假手術同時予以干預，其中假手術組和模型組均給予0.01 ml/g體質量生理鹽水腹腔注射，低、中、高劑量組分別給予1.62、3.24、6.48 μmol/kg牡荊苷溶于0.01 ml/g體質量生理鹽水中腹腔注射(低劑量組所用劑量為牡荊苷的臨床等效劑量，中劑量組、高劑量組所給劑量分別為牡荊苷臨床等效劑量的2倍、4倍)，1次/d，連續3 d。

1.2.3干預前后神經行為學變化 以神經行為學評分表評價各組干預前后神經行為學變化，包括身體對稱性、45°斜面爬行、步態、轉圈、前肢對稱性、強迫轉圈、Whisker反應共7個項目，每個項目分別以0分表示正常，1分表示輕微異常，2分表示明顯異常，3分表示顯著異常，4分表示嚴重異常，共0～28分，評分越高認為神經行為學異常越嚴重[7]。

1.2.4TTC法檢測腦梗死體積 所有大鼠干預后同1.2.1方法實施腹腔麻醉，解剖心臟，于左心室進針，將右心耳剪開以磷酸鹽緩沖液灌注，待流出液體澄清后灌注4%多聚甲醛，多聚甲醛灌注量約和磷酸鹽緩沖液灌注量相同。觀察大鼠舌體和肝臟變化，完全變白后放置于冰塊上斷頭并迅速取腦組織。在-20℃恒溫冰箱中冷凍15 min，冠狀位切5等份，放置于預熱的2% TTC溶液中，37℃避光保存0.5 h，紅色為正常腦組織，白色為腦梗死組織，腦梗死體積(%)=蒼白區質量/總質量×100%。

1.2.5TUNEL法檢測缺血性神經元細胞凋亡率 對腦梗死組織脫水、包埋、連續切片(層厚4 μm)，對切片采用TUNEL試劑盒檢測缺血性神經元細胞的凋亡情況，并以光學顯微鏡觀察。

1.2.6ABC免疫細胞化學法檢測大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元 按照上述方法做切片，60℃烘烤1.5 h，二甲苯透明處理，梯度濃度酒精水化處理。加入0.1%過氧化氫封閉，室溫下等待0.5 h，加入1∶10第二抗體來源的正常山羊血清，室溫下等待1 h。加入1∶2 000兔抗nNOS 多克隆抗體，4℃下等待48 h。PBS沖洗后，給予1∶100 ABC復合物，4℃下等待24 h。PBS沖洗，加入顯色液(0.05%顯色劑+0.01%過氧化氫)，顯色5～7 min，以PBS終止染色，并沖洗。乙醇脫水，二甲苯透明后封片，以光學顯微鏡觀察染色結果，并將圖像信息傳輸至IPP5.0軟件分析系統，測得nNOS積分光度值(IOD)。

1.2.7qRT-PCR檢測大腦紋狀皮質nNOS mRNA表達方法 參照《大鼠腦立體定位圖譜》[8]中標記的具體解剖位置取大腦紋狀皮質組織約1 mm×1 mm×1 mm，清洗并保存于-80℃的恒溫冰箱中，按照TRIzol說明書方法提取總RNA，取1 μl將其作為模板反轉錄為cDNA，以β-actin mRNA作為內參，nNOS引物序列：上游5′-GCGCGGTTACGACTGCT-AGCTG-3′；下游5′-ACTGCTCGATATCTAGTCAAAC-3′；β-actin引物序列：上游5′-TCCGATATAGCTAAACTAGCTA-3′；下游5′-CGCTAGCTAGCTAGCTAG-TTGA-3′。常規配置反應體系，實施擴增反應，PCR反應條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 20 s， 72℃ 20 s，共進行35個循環后，72℃ 5 min。以β-actin mRNA對反應產物進行定量校正和判定，將其拷貝數作為矯正基數，將nNOS mRNA的循環閾值(Ct)值與β-actin mRNA的Ct值求差，可獲得ΔCt，2-ΔΔCt即為nNOS mRNA的相對表達量。

1.2.8Western blot法檢測大腦紋狀皮質nNOS蛋白表達 按照上述方法取大腦紋狀皮質組織約 1 mm3，加入液氮研磨，勻漿后離心取等量蛋白樣品進行電泳、轉膜和封閉處理，根據PVDF膜蛋白標記分子量，在其相應分子量標記位置剪取nNOS蛋白(155×103)、β-actin(37×201)條帶。分別加入兔抗鼠nNOS、β-actin(1∶1 000)4℃過夜，并加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫搖床孵育2 h，曝光后以圖像分析軟件分析nNOS蛋白表達。

2 結果

2.1各組干預前后神經行為學評分對比 模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組分別有2只、3只、2只和1只建模失敗，假手術組有1只死亡。假手術組干預前后神經行為學評分無變化(P>0.05)，模型組干預后較干預前增加(P<0.05)，牡荊苷劑量組均較干預前降低(P<0.05)，且干預后高劑量組<中劑量組<低劑量組<模型組，每2組間差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組干預前后神經行為學評分對比分)Tab.1 Comparison of neurobehavioral scores before and after intervention in each

2.2各組腦梗死體積對比 假手術組無梗死灶，除假手術組外，其余4組腦梗死體積對比差異有統計學意義(P<0.05)，其中高劑量組<中劑量組<低劑量組<模型組，每劑量組間差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組腦梗死體積對比Tab.2 Comparison of volume of cerebral infarction in each

2.3各組腦梗死組織缺血性神經元細胞凋亡率對比 假手術組無缺血性神經元細胞凋亡，模型組可見大量TUNEL染色陽性細胞，杜荊素劑量組TUNEL染色陽性細胞均減少，且以高劑量組最少，見圖1；模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組缺血性神經元細胞凋亡率對比差異有統計學意義(P<0.05)，其中高劑量組<中劑量組<低劑量組<模型組，每劑量組間對比差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組腦梗死組織缺血性神經元細胞凋亡率對比Tab.3 Comparison of apoptotic rates of ischemic neurons in cerebral

圖1 各組腦梗死組織TUNEL染色結果(×200)Fig.1 TUNEL staining results of cerebral infarction tissues in each group(×200)

2.4各組大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元定性和定量結果對比

2.4.1定性結果 大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元多呈棕褐色染色，陽性物質主要位于細胞漿內，胞核透亮，陽性細胞的形態多變，體積小，且陽性細胞體多呈梭形或圓形，每個細胞可見1～3個纖細且長的突起，伸向腦缺血病灶方向。假手術組大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元稀疏、散在，陽性染色較淺；高劑量組大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元稍密集，著色稍深；中劑量組大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元密集，著色加深；低劑量組大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元密集分布；模型組大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元分布最為密集，見圖2。

圖2 大腦紋狀皮質nNOS免疫陽性神經元檢測(×100)Fig.2 Detection of nNOS immunoreactive neurons in striate cortex of brain (×100)

2.4.2定量結果 各組大腦紋狀皮質nNOS IOD值對比差異均有統計學意義(P<0.05)，其中假手術組 <高劑量組 <中劑量組<低劑量組<模型組， 每劑量組間對比差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組大腦紋狀皮質nNOS IOD值對比Tab.4 Comparison of nNOS IOD values in striate cortex of brain in each

2.5各組大腦紋狀皮質nNOS mRNA表達對比 各組大腦紋狀皮質nNOS mRNA表達對比差異均有統計學意義(P<0.05)，其中假手術組<高劑量組<中劑量組<低劑量組<模型組，每兩組間對比差異均有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 各組大腦紋狀皮質nNOS mRNA表達Tab.5 nNOS mRNA expression in the striate cortex of brain in each

2.6各組大腦紋狀皮質nNOS 蛋白表達對比 各組大腦紋狀皮質nNOS 蛋白表達對比差異均有統計學意義(P<0.05)，其中假手術組<高劑量組<中劑量組<低劑量組<模型組，每兩組間對比差異均有統計學意義(P<0.05)，見表6、圖3。

表6 各組大腦紋狀皮質nNOS 蛋白表達Tab.6 Expressions of nNOS protein in the striate cortex of brain in each

圖3 各組大腦紋狀皮質nNOS 蛋白表達檢測Fig.3 Detection of nNOS protein expression in cerebral striate cortex of each groupNote:1.Sham operation group;2.High dose group;3.Medium dose group;4.Low dose group;5.Model group.

3 討論

急性腦缺血是常見的致死致殘疾病，在腦血管疾病中的構成比已超過85%[9]。急性腦缺血可引發神經元損傷，國內外報道的可能機制包括能量衰竭、酸中毒、自由基損傷、興奮性毒性損害、免疫失衡和炎癥反應等[10，11]。有研究指出，急性腦缺血患者神經元損傷過程中免疫失衡是誘發炎癥反應的重要條件，以nNOS陽性神經元數量增多和功能激活最為多見，NOS是催化產生內源性NO的唯一酶類，而內源性NO可作為中樞神經系統細胞間的信使分子，在神經元電生理活動中起到重要的調控作用[12]。NOS可分為原生型和誘導型，前者又可分為神經元型和內皮型，各自執行不同的功能，其中nNOS可能是參與急性腦缺血神經元損傷的重要因子[13]。故調控急性腦缺血組織中nNOS的表達可能是控制病情的重要途徑。

本次研究顯示，除假手術組外，模型組神經行為學評分、腦梗死體積、腦梗死組織缺血性神經元細胞凋亡率均高于其余3組，且在3組間對比顯示，高劑量組<中劑量組<低劑量組，表明牡荊苷在急性腦缺血大鼠中應用能夠改善神經行為學、減少腦梗死體積、降低缺血性神經元細胞凋亡率，且高劑量牡荊苷的作用效果最佳，中劑量牡荊苷的作用效果明顯優于低劑量組。牡荊苷屬于天然黃酮類藥物，具有抗氧化應激、抗腫瘤、抗炎癥反應等作用，在既往的研究報道中已證實該藥物可調控Toll樣受體4(TLR4)和核因子κB(NF-κB)mRNA及蛋白表達，控制氧化應激和炎癥反應，發揮腦保護作用[14]。另有研究指出，牡荊苷可改善急性腦缺血大鼠局部組織的能量代謝，從而可優化局部微環境，為病情控制和神經功能的改善提供依據[15]。國外一項報道中證實，牡荊苷可緩解缺血缺氧性損傷大鼠模型的神經元損傷程度，抑制神經元細胞線粒體凋亡，且可改善其神經行為學[16]。因此，在急性腦缺血大鼠中牡荊苷可發揮腦保護作用。但是關于牡荊苷對神經免疫的作用報道尚少，既往研究推測其對神經免疫具有雙向調控作用，而其是否能夠調節急性腦缺血局部組織的神經免疫表達仍需進一步探討[17]。

此外，本研究還發現，大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元定性和定量結果均顯示，模型組最多，低劑量組次之，中劑量組稍少，高劑量組更少，假手術組最少，可知在急性腦缺血大鼠大腦紋狀皮質nNOS免疫陽性神經元數量顯著增多，給予牡荊苷可降低其數量，且濃度越高效果越佳；在進一步的對比結果中顯示，大腦紋狀皮質組織nNOS mRNA和蛋白表達量組間對比，模型組>低劑量組>中劑量組>高劑量組>假手術組，可知在急性腦缺血發生過程中大腦紋狀皮質nNOS mRNA和蛋白表達量顯著增高，給予牡荊苷干預后可下調其表達，且高劑量牡荊苷的作用最佳。研究發現，在急性腦缺血早期，大腦皮質多個區域均可見nNOS免疫陽性神經元，且Western blot和免疫組化法檢測結果均發現其表達水平顯著增強，以皮層紋狀區、海馬始層、腔隙層等較為常見，且大腦紋狀皮質中其免疫陽性神經元最多，蛋白表達量最高，是其他區域免疫陽性神經元的主要來源[18]。在進一步的研究中顯示，缺血早期上述區域nNOS免疫陽性神經元數量與神經元細胞凋亡率呈正相關，推測nNOS免疫表達增強是導致上述區域成為缺血易損區的重要原因。Shao等[19]的報道指出，大鼠大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元對缺血缺氧性損傷非常敏感，在其刺激下可顯著增加陽性表達數量，并推測很可能參與腦組織損傷和神經缺損的壞死病變過程。結合本研究結果，推測牡荊苷可減少急性腦缺血大鼠大腦紋狀皮質nNOS陽性神經元數量，抑制其表達，并下調其mRNA和蛋白表達。

綜上所述，牡荊苷可改善急性腦缺血大鼠的神經行為學，減小腦梗死體積，降低缺血性神經元細胞凋亡率，且劑量越高作用越佳，推測與減少達到大腦紋狀皮質組織nNOS免疫陽性神經元數量，抑制其免疫表達，下調其mRNA和蛋白表達有關，為急性腦缺血患者的臨床治療研究提供了新方向。但關于牡荊苷對皮層紋狀區nNOS免疫表達的調控機制仍需要深入探討，可作為進一步的研究方向。