KDM5B在宮頸癌中的表達意義及對宮頸癌干細胞的影響

楊寶娟 張 慶 王志紅 王武亮 張 珂

(鄭州大學第二附屬醫院婦產科，鄭州 450000)

宮頸癌發病率居全球女性惡性腫瘤第二位，死亡率位居女性生殖系統相關死亡的第一位[1]。流行病學調查全球每年有50萬例左右宮頸癌新發病例和28萬例左右宮頸癌相關死亡病例[2]。由于復發和轉移使得宮頸癌患者預后較差，因此研究宮頸癌復發和轉移的機制尤為重要[3]。腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)被認為具有自我更新能力，啟動和驅動腫瘤細胞生長和轉移，在腫瘤復發和轉移中發揮關鍵作用[4，5]。但是CSCs是存在于腫瘤細胞中的一小部分群體，需要鑒定和分離，現有研究報道宮頸癌中可以鑒定分離出宮頸癌干細胞(cervical cancer stem cells,CCSCs)[6，7]。CCSCs具有增殖快、軟瓊脂克隆形成、轉移能力強和致瘤性等生物學特性即為干性，CCSCs干性同樣受到驅動基因、抑制基因和表觀遺傳學修飾相關基因等的調控[8-10]。組蛋白去甲基化轉移酶(lysine demethylation 5B,KDM5B) 主要在正常睪丸組織中表達，近年來研究報道KDM5B 在肝癌、頭頸部鱗狀細胞癌及卵巢癌等常見的人類惡性腫瘤中表達上調，并在腫瘤增殖轉移等惡性生物學行為中發揮重要作用[11-13]。KDM5B在宮頸癌中的表達水平及對CSCs的調控作用目前尚無文獻報道，因此本文旨在研究KDM5B在宮頸癌組織中的表達水平和與患者臨床病理特征的關系，及其在CSCs干性調控中發揮的作用，為發掘治療宮頸癌新的分子基因靶點提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1組織樣本 收集2011年1月～2013年1月入住我院的宮頸癌患者，獲得手術切除宮頸癌組織70例，患者年齡25～75歲，平均年齡(45.04±21.36)歲，要求所有患者具有完整的病歷資料和隨訪資料，并且未患有其他腫瘤或嚴重威脅生命健康的疾病，術前未接受放化療、靶向治療等任何形式的抗腫瘤治療，由兩位或兩位以上的病理專家共同證實為宮頸癌，另選取30例因良性病變切除的正常宮頸組織，未合并其他腫瘤或威脅生命健康疾病的患者作為對照，患者年齡30～70歲，平均年齡(47.34±19.95)歲。宮頸癌組與對照組患者的年齡相比，差異無統計學意義。所有患者簽署知情同意書，并由我院倫理委員會審核通過。

1.1.2試劑與儀器 SP試劑盒、非免疫羊血清、DAB顯色試劑盒均購于上海碧云天有限公司；加拿大中性樹膠購于Solarbio公司；宮頸癌Caski細胞系和人宮頸上皮永生化細胞H8均購自美國ATCC細胞庫；DMEM-F12、DMEM高糖培養基及胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司；KDM5B siRNA由上海吉凱有限公司設計合成；蛋白裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒均購自美國Thermo公司；MTS購自美國Biovision公司；Transwell小室購自南京凱基生物技術有限公司；兔抗人KDM5B多克隆抗體(ab198884)、兔抗人OCT4多克隆抗體(ab181557)、鼠抗人Nanog多克隆抗體(ab109250)、兔抗人SOX2多克隆抗體(ab97959)和兔抗人GAPDH多克隆抗體(ab181602)均購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學 采用SP免疫組織化學檢測KDM5B蛋白的表達，組織樣本在4%中性甲醛固定48 h以上，石蠟包埋，切成4 μm切片，70℃烘烤 2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脫蠟15 min，70%、80%、90%、100%梯度酒精及雙蒸水，水化，置于檸檬酸鈉溶液中進行高溫高壓抗原修復，PBS沖洗2次后，室溫3%過氧化氫甲醇溶液避光孵育30 min，以去除內源性過氧化物酶活性，滴加非免疫羊血清室溫封閉1 h，滴加1∶100稀釋的KDM5B一抗工作液，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次后滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS 洗滌3次后DAB試劑顯色，蘇木素染細胞核，常規梯度酒精脫水，干燥后加拿大中性樹膠封片。

在低倍顯微鏡下計數100個細胞，隨機計數5個視野。細胞內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，按染色程度計分：無黃色計0分，淺棕黃色計1分，棕黃色計2分，深棕黃色計3分。根據陽性細胞所占比例計分，無陽性細胞計0分，<25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；>75%計4分。按染色程度和陽性細胞所占比例評分綜合判定，二者之和≤3分為陰性表達，>3分為陽性表達。術后電話及門診隨訪1～60個月，患者死亡或者時間截止時隨訪終止[14]。

1.2.2細胞培養及轉染 Caski、H8細胞用DMEM-F12培養基+10%FBS培養，置于37℃、5%CO2培養箱中。用無血清培養基將Caski細胞培養成腫瘤球，將對數生長期的腫瘤球制成單個細胞后重懸于FACS緩沖液中，實驗組加入CD133 FITC 10 μl，對照組加入10 μl同型對照抗體，于4℃避光孵育30 min，每10 min混懸細胞1次，流式細胞儀上機分選出CD133+細胞CCSCs，擴大培養。流式細胞術檢測擴大培養后CD133 陽性細胞率。將呈對數生長期的CCSCs細胞胰酶消化后鋪至6孔板中，細胞完全貼壁后將脂質體2000與KDM5B siRNA和對照組轉染試劑按說明書轉染至細胞中，分為KDM5B siRNA(si-KDM5B)和對照組(si-NC)，放至培養箱中培養。KDM5B siRNA序列：ATCGCTTGCTTCATCGATATT。

1.2.3MTS增殖實驗 收集轉染48 h后的各組細胞，胰酶消化計數后以每孔150 μl培養基、2 000個細胞接種于96孔板中，組內為6個復孔，鋪板后放至培養箱中培養，分別在鋪板后第0、1、2、3和4天時(即組間設5個平行復孔)，每孔加入30 μl MTS工作液，培養箱中孵育2 h，全波長掃描儀在490 nm波長處測取吸光度OD值，OD值越高提示細胞的增殖能力越強。實驗重復3次。

1.2.4軟瓊脂克隆形成實驗 1.2%高壓滅菌的軟瓊脂與無血清培養基1∶1混勻后，均勻鋪至培養皿底部冷卻至固態作為底層膠。0.6%高壓滅菌的軟瓊脂與無血清培養基1∶1充分混勻37℃預熱后，與100 μl 1×105個各組細胞混勻鋪至底層膠上，放置培養箱中培養，每天顯微鏡下觀察并拍照。實驗重復3次以上。

1.2.5Transwell小室實驗 收集轉染48 h后的各組細胞，無血清培養基洗3次，以每孔1×105個細胞重懸至100 μl無血清培養基中，接種于Transwell小室的上室，500 μl完全培養基加入下室作為趨化因子，置培養箱中培養，顯微鏡下觀察下室穿過10個細胞時終止培養，取出微孔膜，PBS洗滌3次，甲醇固定15 min，蘇木素染色。隨機計數顯微鏡下5個視野穿過的細胞，穿過細胞的數量越多，細胞的轉移能力越強，取5個視野的均值代表細胞轉移能力。實驗重復3次以上。

1.2.6裸鼠移植瘤 按說明書將KDM5B干擾質粒及對照NC，以復感染指數MOI(病毒/細胞數量)20感染CCSCs，分為KDM5B sh-RNA組和NC組。96 h后添加含1.0 μg/ml G418(遺傳霉素)的新鮮培養基培養，隔天添加1次，直至所有細胞均可觀察到熒光。將篩選的穩轉細胞株CCSCssh-KDM5B和CCSCsNC分別以每只1×107個/100 μl注射到4周齡左右的裸鼠右側腋下，每組5只裸鼠。每3 d用游標卡尺測量瘤體積，4周左右處死裸鼠，該實驗的所有操作均符合動物倫理學。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達 收集轉染48 h后的各組細胞，加入蛋白裂解液(含有100×的蛋白酶和磷酸酶抑制劑)反復吹打，14 000 r/min、裂解30 min，4℃離心，20 min，上清液移至新的EP管中，BCA測蛋白濃度，煮沸變性后上樣SDS-PAGE電泳，以濕轉的方式將蛋白移至PVDF膜上，8%脫脂牛奶室溫封閉3 h，TBST洗滌3次后加入目的基因一抗孵育4℃過夜，TBST洗滌3次后，二抗室溫孵育2 h，ELC化學發光法曝光條帶。實驗重復3次以上。

2 結果

2.1KDM5B在宮頸癌組織中的表達及其與患者臨床病理特征的關系 KDM5B在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達陽性率分別為68.57%(48/70)、36.67%(11/30)，宮頸癌組織中KDM5B陽性表達率顯著高于正常宮頸組織(χ2=8.837，P=0.003)。KDM5B在宮頸癌組織中的表達水平與患者的年齡、TNM分期和組織學分級均無關，差異無統計學意義(P>0.05)。KDM5B與宮頸癌腫瘤大小、淋巴結轉移顯著相關 (均P<0.05)。見表1。

表1 KDM5B在宮頸癌組織中的表達水平與臨床病理特征之間的關系[例(%)]Tab.1 Expression of KDM5B in cervical carcinoma and its relationship with clinicopathologic features[n(%)]

2.2宮頸癌組織中KDM5B的表達水平對患者預后的影響 對70例宮頸癌患者進行術后隨訪，并按KDM5B在宮頸癌癌組織中的表達水平分為KDM5B陽性表達組和KDM5B陰性表達組。Kaplan-Meier生存分析結果顯示：KDM5B陽性表達組宮頸癌患者的5年總生存率明顯短于KDM5B陰性表達組(Logrankχ2=23.081，P=0.000，圖1)。

圖1 宮頸癌組織中KDM5B的表達水平與患者術后生存時間的關系Fig.1 Relationship between expression of KDM58 in cer-vical carcinoma and postoperative survival time

2.3KDM5B在CCSCs中的表達水平 利用流式細胞術將Caski細胞分離培養的腫瘤球進行分選，篩選出CD133+細胞擴大培養后，流式細胞儀檢測CD133+細胞為97.66%，Western blot檢測KDM5B在CD133+細胞中的表達顯著高于在宮頸癌細胞Caski和人宮頸上皮永生化細胞H8中的表達，H8細胞中的表達最低(圖2)。

圖2 KDM5B蛋白在CCSCs中的表達Fig.2 Expressions of KDM5B protein in CCSCsNote:Compared with CD133+，*.P<0.05.

2.4抑制KDM5B表達對CCSCs增殖的影響 MTS法測定si-KDM5B和NC組CCSCs的增殖能力，結果顯示，與NC組相比，si-KDM5B組細胞增殖能力明顯減慢(P<0.05，圖3)。

圖3 MTS檢測KDM5B對CCSCs增殖能力的影響Fig.3 MTS detected effect of KDM5B on proliferation ability of CCSCsNote:Compared with si-NC group，*.P<0.05.

2.5抑制KDM5B表達對CCSCs克隆形成能力的影響 采用軟瓊脂克隆實驗測定si-KDM5B和NC組CCSCs的克隆形成能力，結果顯示si-KDM5B組腫瘤克隆球形成明顯小于NC組。si-KDM5B組腫瘤克隆球形成能力明顯弱于NC組(圖4)。

圖4 軟瓊脂克隆形成實驗檢測KDM5B對CCSCs克隆形成能力的影響Fig.4 Soft agar clone formation assay detected effect of KDM5B on colony forming ability of CCSCs

2.6抑制KDM5B表達對CCSCs轉移能力的影響 采用Transwell小室測定si-KDM5B和NC組CCSCs的轉移能力，結果顯示si-KDM5B和NC組細胞穿膜數分別為(48.43±8.14) 個、(96.32±10.28)個。si-KDM5B組細胞轉移能力明顯低于si-NC組(P<0.05，圖5)。

圖5 Transwell檢測KDM5B對CCSCs轉移能力的影響Fig.5 Transwell detected effect of KDM5B on metastasis ability of CCSCs

2.7抑制KDM5B表達對CCSCs致瘤性的影響 分別注射CCSCssh-KDM5B和CCSCsNC后，CCSCssh-KDM5B組裸鼠體積顯著低于CCSCsNC組(P<0.05，圖6)。

圖6 KDM5B對CCSCs致瘤能力的影響Fig.6 Effect of KDM5B on tumorigenicity of CCSCsNote:A.Nude mice were dissected for tumor size;B.Vernier caliper was used to measure the tumor volume of nude mice；compared with CCSCsNC group,*.P<0.05.

2.8抑制KDM5B表達對CCSCs干性基因的影響 Western blot結果顯示，與NC組相比，si-KDM5B組OCT4、 Nanog和SOX2蛋白表達顯著降低(圖7)。

圖7 Western blot檢測KDM5B對CCSCs干性基因蛋白表達的影響Fig.7 Western blot analysis of effect of KDM5B on dry gene protein expression of CCSCsNote:Compared with Si-NC group，*.P<0.05.

3 討論

宮頸癌是嚴重威脅全球女性健康的常見婦科腫瘤，發病率和死亡率較高[1，2]。宮頸癌患者早期癥狀的隱匿性，使得大多數患者確診時已處于晚期，容易出現化療藥物抵抗及復發，是目前宮頸癌治療面臨的巨大挑戰[15，16]。CSCs作為解釋同一腫瘤內腫瘤細胞具有不同的表型和功能異質性的模型，對腫瘤的增殖和侵襲轉移等惡性生物學行為均具有重要的促進作用，同時CSCs可以作為藥物靶點，消除CSCs可以克服宮頸癌細胞的鉑類化療耐藥。

CSCs雖然是腫瘤細胞中的一小部分細胞，但卻是腫瘤細胞發生的起始，是促進腫瘤復發耐藥的關鍵，具有促進腫瘤增殖、侵襲和轉移等生物學行為的特性，即干性，而干性通常是由癌基因及抑癌基因等相關關鍵因子調控[8-10]。Huang等[17]研究發現分化抑制因子ID3可以通過增加β-連環蛋白的轉錄活性來促進肝內膽管細胞癌(ICC)干細胞的干性，并且可以作為預測ICC患者對輔助化學療法反應的新型生物標志物。軟骨寡聚基質蛋白(COMP)在乳腺癌細胞中陽性表達與患者的低存活率和較高的復發率相關，并在體內和體外實驗中表明COMP表達增加了乳腺癌中癌癥干細胞的比例，其通過增加Notch3和Jagged1之間的相互作用來調節癌癥干細胞群[18]。T-box轉錄因子3(Tbx3)通過控制干細胞自我更新和分化來調節干細胞的維持從而促進宮頸癌的發生發展[18]。研究報道KDM5B在多種腫瘤中表達上調，并發揮重要作用，KDM5B也稱為JARID1，2007年首次被鑒定為組蛋白去甲基化酶，通過參與調控靶基因啟動子周圍的多個抑制性轉錄復合物，發揮廣泛調節染色質結構的作用[19]。KDM5B與其他三個家族成員KDM5A、KDM5C和KDM5D共同組成KDM5家族，KDM5家族包含五個保守結構域：催化JmjC結構域、N末端JmjN結構域、ARID結構域、PHD指結構域和C5CH2結構域，參與去甲基化酶活性[20]。越來越多的研究表明KDM5B具有致癌作用，KDM5B在乳腺癌組織中高表達，采用KDM5蛋白小分子抑制劑抑制KDM5B蛋白的表達導致乳腺癌細胞活力下降[21]。在胃癌中，KDM5B通過調節Akt通路來促進腫瘤細胞生長和轉移[22]。腫瘤細胞可利用KDM5A獲得順鉑等細胞毒性劑的化療耐受性[23]。根據KDM5B促癌的生物學功能推測其可能與CSCs干性相關，研究發現JARID1B/KDM5B過表達導致非小細胞肺癌細胞增殖增加和腫瘤球形成，與CSCs和上皮-間質轉化(EMT)標志物的表達呈正相關[24]。KDM5B在維持類似肝細胞癌CSCs的特征中起重要作用，敲減KDM5B的表達抑制了腫瘤細胞體外腫瘤球形成和侵襲[25]。Zhou等[26]報道KDM5B在宮頸癌細胞中升高主要逆轉miR424-5p觸發的細胞增殖抑制和細胞凋亡增加，沉默KDM5B表達同樣抑制細胞生長，但是KDM5B與CCSCs的相關研究尚未見有報道。

為了研究KDM5B在CCSCs中發揮的作用，本研究采用免疫組化方法檢測KDM5B在宮頸癌中的表達水平，結果顯示KDM5B在宮頸癌組織中的表達顯著高于正常宮頸組織，發現KDM5B蛋白陽性表達與宮頸癌腫瘤大小及淋巴結轉移相關。采用Kaplan-Meier生存曲線發現KDM5B陽性表達與患者預后顯著相關，KDM5B陽性表達患者5年總生存期較短。Huang等[12]同樣采用免疫組化分析KDM5B在頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)組織和癌旁上皮組織中的表達，結果發現SCCHN中KDM5B的表達高于相鄰的非癌組織，并與淋巴結轉移和腫瘤復發及預后密切相關。KDM5B在肝細胞癌組織中的表達增加與腫瘤體積大、TNM分期晚期和患者的總體存活率降低顯著相關[11]。以上結果均提示KDM5B可能參與腫瘤的發生發展。

CSCs在腫瘤細胞中的含量較低，并且分離存在一定的困難，無血清懸浮培養法和流式細胞儀基于CSCs表面免疫學分子標志物分選法是目前分離CSCs的主要方法，CD133已被證實為CCSCs表面免疫學分子標志物之一[27-29]，本文結合兩種方法篩選出97.66%的CD133+細胞為CCSCs。而Western blot檢測發現KDM5B在CCSCs中的表達顯著高于在宮頸癌細胞Caski和人宮頸上皮永生化細胞H8中的表達，H8細胞中的表達最低，與其在宮頸癌組織水平表達具有一致性，采用小干擾RNA技術干擾目的基因KDM5B的表達研究其對CCSCs的影響，MTS增殖實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、Transwell實驗和裸鼠成瘤實驗結果顯示抑制CCSCs細胞中KDM5B基因的表達后細胞增殖、克隆形成能力、轉移能力和致瘤能力均下降，即抑制CCSCs的干性。功能實驗結果表明KDM5B基因可能為CCSCs干性的促進因子。八聚體結合轉錄因子4(octamer-binding transcription factor,OCT4)是維持正常干細胞和CSCs特征的主要轉錄因子，可以調控其他Nanog、SOX2等干性因子，OCT4、 Nanog、SOX2均為CSCs干性標志物，對CCSCs的干性均具有主要作用，因此采用Western blot檢測KDM5B對OCT4、 Nanog和SOX2干性基因蛋白的表達影響，結果顯示抑制KDM5B的表達后，CCSCs中蛋白的表達下降，表明KDM5B可能促進CCSCs的干性[30-32]。

綜上所述，KDM5B在宮頸癌組織和CCSCs中高表達，與宮頸癌患者的腫瘤大小和淋巴結轉移相關，干擾KDM5B的表達顯著抑制CCSCs的干性，KDM5B在宮頸癌的治療中具有潛在作用，可以為干預宮頸癌惡性生物學行為提供新的思路。