Treg和Th17在卵巢癌患者外周血中的意義及與預后的相關性分析①

李元昆 崔金全 廖予妹 魯笑欽 胡 濱 顧曉荔

(鄭州大學第二附屬醫院婦科，鄭州 450000)

卵巢癌是臨床常見的女性生殖系統惡性腫瘤，發病率僅次于宮頸癌及宮體癌，病死率居于婦科惡性腫瘤首位[1]。卵巢癌起病隱匿，確診時多數患者已進展至中、晚期，病情進展迅速、預后生存期短[2]。因此，了解卵巢癌發病機制，尋找有效預測疾病預后的腫瘤標志物對疾病診療具有重要意義。研究表明，免疫失衡可能參與卵巢癌的發生和發展，但具體調控機制尚未明確[3]。CD4+T淋巴細胞亞群中調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)與輔助性T細胞17(helper T cells 17，Th17)處于平衡狀態，疾病狀態下兩者在外周血中數量、功能均發生異常，近年來Th17與Treg平衡狀態與腫瘤的關系報道較多，但關于其在卵巢癌發生發展中的可能作用報道較少，需要進一步研究探討[4，5]。本研究通過流式細胞術檢測各臨床分期卵巢癌患者及健康體檢者外周血中Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率，分析二者在卵巢癌發生發展中的可能作用，并采用Logistic回歸分析法分析導致卵巢癌預后死亡的危險因素，明確Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率與疾病預后死亡的相關性，以期為臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2015年10月～2016年9月鄭州大學第二附屬醫院收治的105例卵巢癌患者設為卵巢癌組，年齡32～71歲，平均年齡(50.82±6.15)歲；按照國際婦產聯合會(International Federa-tion of Gynecology and Obstetrics，FIGO)卵巢癌臨床分期分為Ⅰ期17例，Ⅱ期27例，Ⅲ期41例，Ⅳ期20例[6]；組織分型為漿液性囊腺癌79例，黏液性囊腺癌20例，子宮內膜樣癌6例；單側腫瘤41例，雙側腫瘤64例。所有患者均經病理證實為卵巢癌，排除其他類型惡性腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病、合并嚴重肝腎功能障礙者。所有患者治療均以手術切除為主，術后輔助化療時間≤6個療程者63例，>6個療程者42例；術后殘存病灶≤1 cm者51例，>1 cm 者54例。另取同期體檢中心45例健康體檢者為健康組。本研究獲得醫院倫理委員會批準， 所有受試者均簽署知情同意書。

1.1.2試劑與儀器 RPMI1640培養液(武漢普諾賽生命科技有限公司);氟波酯、離子霉素、布雷桿氏菌素A(美國Sigma公司);破膜劑(美國Invitrogen公司);CD4-FITC、Alexa Fluor647 IL-17、PE-Foxp3單克隆抗體(美國Abcam公司);BD LSRFortessa X-20型流式細胞儀(美國BD公司)

1.2方法

1.2.1標本收集、外周血單個核細胞分離及培養 所有患者采集靜脈血前均未進行手術、化療及免疫治療。采集卵巢癌患者及健康受試者空腹靜脈血5 ml，肝素抗凝，2 h內處理完畢。取100 μl肝素抗凝血，加入100 μl RPMI1640培養液混勻，加入10 μl濃度為25 μg/L的氟波酯工作液、10 μl濃度為1.0 g/L 的離子霉素工作液、20 μl濃度為1.7 g/L的布雷桿氏菌素A工作液，混勻后于37℃、5%CO2條件下刺激培養3 h備用。

1.2.2Th17、Treg細胞檢測 取刺激培養3 h的全血細胞600 μl，2 000 r/min離心2 min，取沉淀細胞，加入10 μl CD4-FITC單抗，避光孵育15 min，PBS洗滌后加入100 μl固定液，避光孵育15 min，PBS再次洗滌、離心后，取沉淀細胞，加入100 μl破膜劑，輕柔混勻，避光孵育5 min，加入10 μl Alexa Fluor647 IL-17抗體(或10 μl PE-Foxp3抗體)，混勻后避光孵育15 min，PBS再次洗滌細胞，離心取沉淀細胞后，流式細胞術檢測Th17、Treg細胞百分率。

1.2.3臨床資料統計 查閱病例及復診記錄，統計可能影響患者預后生存的相關因素，包括年齡、是否絕經、腫瘤位置、組織分型、組織分化程度、臨床分期、殘存病灶大小(手術切除后病灶大小)、化療療程、Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率。

1.2.4隨訪 以電話或復診方式隨訪，隨訪統計患者3年期間生存情況，以有明確病理學診斷的確診時間為起始時間，以死亡或隨訪截止時間(3年)為終止。所有患者均完成隨訪，無失訪病例。將3年內死亡患者納入死亡組，其余為生存組。

1.2.5Logistic回歸分析法賦值 分別以是否絕經(是=0、否=1)、腫瘤位置(單側=0、雙側=1)、組織分型(漿液性囊腺癌=0、黏液性囊腺癌=1、子宮內膜樣癌=2)、組織分化程度(高分化=0、中分化=1、低分化=2)、臨床分期(Ⅰ～Ⅱ期=0、Ⅲ～Ⅳ期=1)、殘存病灶大小(≤1 cm=0、>1 cm=1)、化療療程(>6=0、≤6=1)及連續變量年齡、Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率等可能導致患者死亡的因素為自變量，以生存情況(生存=0、死亡=1)為因變量進行多因素Logistic回歸分析。

1.2.6觀察指標 ①健康組與卵巢癌組Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率比較；②不同臨床分期卵巢癌患者Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率比較；③Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率及其他可能影響卵巢癌預后的因素比較；④影響卵巢癌預后因素的Logistic回歸分析。

2 結果

2.1健康組與卵巢癌組Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率比較 卵巢癌組Th17百分率[(2.94±0.61)%]高于健康組[(1.05±0.24)%]，差異有統計學意義(t=20.097，P<0.001)；卵巢癌組Treg百分率[(13.65±1.44)%]高于健康組[(5.80±1.01)%]，差異有統計學意義(t=33.206，P<0.001)；卵巢癌組Th17/Treg細胞百分率[(21.54±2.47)%]高于健康組[(18.10±2.01)%]，差異有統計學意義(t=8.241，P<0.001)。

2.2不同臨床分期卵巢癌患者Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率及Th17/Treg比較 Ⅲ～Ⅳ期患者Th17百分率為[(3.05±0.70)%]，高于Ⅰ～Ⅱ期患者的[(2.79±0.41)%]，差異有統計學意義(t=2.204，P=0.030)；Ⅲ～Ⅳ期患者Treg百分率為[(14.14±2.17)%]高于Ⅰ～Ⅱ期患的[(12.97±1.35)%]，差異有統計學意義(t=3.160，P=0.002)；Ⅲ～Ⅳ期患者Th17/Treg細胞百分率為[(21.57±2.32)%]，Ⅰ～Ⅱ期患者為[(21.51±2.67)%]，差異無統計學意義(t=0.123，P=0.903)。

2.3可能影響卵巢癌預后的因素比較 隨訪3年均無脫落患者，3年存活率為68.57%(72/105)；死亡組和存活組患者年齡、是否絕經、腫瘤位置、組織分型及分化程度分布情況比較差異均無統計學意義(P>0.05)；死亡組臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、殘存病灶>1 cm、化療≤6個療程患者構成比及Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率均高于存活組，差異均有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 可能影響卵巢癌預后的因素比較Tab.1 Comparison of factors that may affect the prognosis of ovarian cancer

2.4影響卵巢癌預后因素Logistic回歸分析 經Logistic回歸分析，臨床分期、殘存病灶大小、化療療程、Th17、Treg及Th17/Treg細胞百分率均是導致卵巢癌預后死亡的危險因素(OR=2.670、2.776、2.246、4.145、2.659、3.971，P<0.05，表2)。

表2 影響卵巢癌預后因素Logistic回歸分析Tab.2 Logistic regression analysis of factors affecting the prognosis of ovarian cancer

3 討論

目前，卵巢癌發病機制尚未完全闡明，研究者認為可能涉及女性外源性激素、遺傳、環境及免疫功能等多種因素。研究表明，多種惡性腫瘤均存在外周血T淋巴細胞亞群失衡狀態，新近發現的Treg、Th17失衡已逐漸成為研究熱點[7,8]。Th17主要以高水平分泌IL-17為特征參與自身免疫及過敏反應過程[9]。Treg屬于免疫負調控細胞，在腫瘤免疫耐受中發揮重要作用。研究證實，卵巢癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤患者外周血均存在Treg和Th17數量增多現象[10,11]。因此，研究腫瘤微環境中Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率變化對了解疾病狀態、預后預測有重要意義。

本研究中，卵巢癌組Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率均高于健康組，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者Th17、Treg百分率高于Ⅰ～Ⅱ期患者，Ⅲ～Ⅳ期與Ⅰ～Ⅱ期患者Th17/Treg細胞百分率無明顯差異，提示外周血Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率變化可能參與卵巢癌發生發展。Zhu等[12]通過檢測126例卵巢癌及26例卵巢良性腫瘤組織標本發現，上皮性卵巢癌較卵巢良性組織中Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率更高，且晚期上皮性卵巢癌中二者百分率較早期更高，提示Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率與上皮性卵巢癌疾病嚴重程度有關，與本研究結果相符。既往研究表明，Treg細胞在腫瘤微環境中表達增加，可能與癌細胞及腫瘤相關巨噬細胞分泌大量CC基序趨化因子配體-22，從而招募Treg細胞發揮免疫抑制作用，促進癌細胞增過程有關[13]。此外，Treg所分泌的TGF-β可促進Th17分化過程，使腫瘤微環境長期維持慢性炎癥狀態，而Th17大量分泌IL-17可促進癌細胞遷移[14-16]。因此，Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率增高可能促進卵巢癌發生發展，其原因可能為Th17、Treg細胞失衡導致腫瘤微環境免疫失衡，促進癌細胞增殖、遷移等過程，導致腫瘤進一步發展。

此外，本研究中死亡組臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、殘存病灶>1 cm、化療≤6個療程患者構成比及Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率均高于存活組；經Logistic回歸分析發現，臨床分期、殘存病灶大小、化療療程、Th17及Treg百分率均是導致卵巢癌預后死亡的危險因素，提示影響卵巢癌患者預后的危險因素較多，除臨床分期、殘存病灶大小及化療療程等常規危險因素外，外周血Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率與疾病預后也密切相關。Fu等[17]研究發現外周血T淋巴細胞亞群變化與乳腺癌術后免疫抑制有關，且與疾病預后生存期關系密切。Yang等[18]證實，Treg、Th17失衡與肺癌患者預后不良顯著相關，與本研究結果相似。由此可知，Treg、Th17升高及比例失衡可能提示卵巢癌局部微環境免疫失衡，導致癌細胞增殖及遷移風險增加，進而導致疾病的預后不良。綜上所述，外周血Th17、Treg、Th17/Treg細胞百分率變化可能參與卵巢癌發生發展，且與疾病預后關系密切，進一步提示臨床中應注重調控Treg和Th17的平衡狀態，對改善卵巢癌預后有重要意義。