去鐵胺在甲基汞誘導細胞鐵死亡中的作用及其機制

劉婷婷，董麗華，張宇，徐偉，朱海濤，李芳，王蘇華，邢光偉，陸榮柱

(1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013；2.常州市第一人民醫院檢驗科，江蘇 常州 213000；3.江蘇大學附屬醫院醫學影像科，江蘇 鎮江 212001)

汞是一種天然存在的金屬元素，可分為無機汞和有機汞[1]。水生微生物通過促進無機汞的甲基化使其成為毒性更大的甲基汞而更易在食物鏈中產生生物富集[2]。人類主要通過食用含甲基汞的魚類而暴露于甲基汞中[3]。中樞神經系統是甲基汞毒性的主要靶器官[4]，近來甲基汞致肝臟和腎臟等非神經系統的損傷也逐漸引起關注[5-6]。鐵死亡是一種新命名的以鐵依賴性脂質過氧化為特征的程序性死亡方式[7]；其廣泛參與神經[8]及肝臟系統的缺血缺氧損傷[9]，且多與谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPx4)表達下降有關[10]。但甲基汞與鐵死亡之間的關系尚不明確。Fe2+作為脯氨酸羥化酶活性的重要輔因子，在缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的降解中起重要作用。HIF-1α是一種普遍存在于哺乳動物體內，為適應低氧環境而表達的轉錄調節因子。前期研究表明甲基汞的毒性與脯氨酸羥化酶活性增強進而促進HIF-1α降解有關[11]，由此推測甲基汞增強脯氨酸羥化酶的活性可能與Fe2+負載有關。去鐵胺可以抑制甲基汞的氧化毒性[12]，其作為鐵離子螯合劑可抑制鐵死亡[13-14]，同時去鐵胺可抑制脯氨酸羥化酶的活性從而抑制HIF-1α降解[15]，但去鐵胺拮抗甲基汞的毒性效應是否是通過抑制鐵死亡而實現的尚不明確。因此，本研究一方面探討甲基汞的毒性與鐵死亡之間的關系，另一方面選用去鐵胺作為鐵死亡抑制劑，探討其在甲基汞致細胞損傷中的作用和相關分子信號機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞系和正常大鼠肝BRL細胞購自中國科學院細胞生物學研究所；甲基汞、二甲基亞砜、MTT(美國Sigma公司)；DMEM高糖培養基(美國HyClone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；兔抗HIF-1α單克隆抗體(美國ImmunoWay公司)；兔抗GPx4單克隆抗體、去鐵胺試劑(英國Abcam公司)；羊抗兔二抗、β-肌動蛋白(美國Santa Cruz公司)；蛋白濃度相關試劑盒、抗體稀釋液、上下分離膠配置試劑盒(碧云天試劑公司)。

1.2 細胞培養

PC12細胞和BRL細胞置于-80 ℃冰箱保存，進行細胞實驗時，取出置于37 ℃水浴鍋中快速搖動復蘇，完全融化后轉移至含10%胎牛血清的高糖培養基的培養皿中，并置于37 ℃、含5%CO2的細胞培養箱進行培養；隔2 d用胰酶進行消化傳代并繼續培養；待細胞均勻鋪滿孔底75%～85%時進行后續實驗。傳代次數不超過10代。

1.3 細胞分組和處理

取PC12細胞和BRL細胞以5 000個/孔密度接種于96孔板，以50 000個/孔接種于6孔板，待細胞均勻鋪滿孔底75%～85%時進行后續實驗。

細胞分組：對照組用含10%胎牛血清的高糖培養基處理細胞0.5 h；實驗組用含不同濃度甲基汞(1.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L)培養基處理細胞0.5 h。用MTT法檢測細胞活力，蛋白印跡法檢測GPx4蛋白表達。篩選最適濃度甲基汞進行后續實驗。

1.4 MTT法檢測細胞活力

取“1.3”處理后細胞；棄培養基，每孔加入100 μL含0.05 g/mL MTT溶液的培養基，繼續培養4 h；棄培養基，加入150 μL二甲基亞砜溶液，避光并充分振蕩混勻；利用酶標儀檢測490 nm波長處光密度(D)值，并計算細胞活力。細胞活力=(實驗組D值-空白組D值)/(對照孔D值-空白組D值)。

1.5 蛋白印跡實驗檢測HIF-1α及GPx4蛋白表達

收集“1.3”處理后細胞，用預冷PBS洗滌3次，用含1% PMSF的RIPA裂解緩沖液冰上裂解10～15 min；收集至EP管，4 ℃以12 000×g離心15 min，收集上清液；用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白質濃度；加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min；80 V經SDS-PAGE分離蛋白；300 mA 90 min轉至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉2 h；TBST緩沖液洗膜3次；加入對應的一抗稀釋液(HIF-1α和GPx4為1 ∶1 000，β-肌動蛋白為1 ∶10 000，稀釋液為5%脫脂牛奶)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入HRP標記的羊抗兔二抗(TBST稀釋，1 ∶10 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜3次；將PVDF膜置于凝膠成像系統，加入一定的曝光劑進行曝光、成像分析，Lane 1D軟件用于灰度分析。

1.6 去鐵胺預處理對細胞活力及GPx4和HIF-1α蛋白表達的影響

取PC12細胞和BRL細胞以5 000個/孔密度接種于96孔板中，以50 000個/孔接種于6孔板，待細胞均勻鋪滿孔底75%～85%時進行后續實驗。

細胞分組：對照組用含10%胎牛血清的高糖培養基處理細胞 6.5 h；去鐵胺+甲基汞組分別用0、50、100、200、400 μmol/L去鐵胺預處理6 h，棄培養液，加10.0 μmol/L甲基汞繼續培養0.5 h。用MTT法分析細胞活力，蛋白印跡法檢測GPx4和HIF-1α蛋白表達，具體方法同“1.4”和“1.5”。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 甲基汞降低PC12細胞和BRL細胞活力

MTT結果顯示，與對照組相比，在PC12細胞中，5.0 μmol/L和10.0 μmol/L甲基汞處理后，細胞活力明顯降低(q=5.754、9.761，P均<0.05)；與5.0 μmol/L甲基汞組相比，10.0 μmol/L甲基汞組細胞活力下降更顯著(q=4.077，P<0.05)，呈一定的劑量依賴性。在BRL細胞中，10.0 μmol/L甲基汞組細胞活力較對照組明顯降低(q=10.67，P<0.05)。因此，選擇10.0 μmol/L甲基汞進行后續實驗。見圖1。

a:P<0.05，與對照組比較;b:P<0.05,與5.0 μmol/L比較圖1 MTT法檢測不同濃度甲基汞處理后兩種細胞活力的變化

2.2 甲基汞降低PC12細胞和BRL細胞中GPx4蛋白表達

免疫印跡結果顯示，與對照組相比，在PC12細胞中，2.5、5.0、和10.0 μmol/L甲基汞處理后，GPx4蛋白表達明顯降低(q=4.220、5.601、6.817，P均<0.05)；在BRL細胞中，5.0和10.0 μmol/L甲基汞組GPx4蛋白表達明顯降低(q=3.618、3.955，P均<0.05)。見圖2。

a:P<0.05，與對照組比較圖2 免疫印跡法檢測不同濃度甲基汞處理后兩株細胞中GPx4蛋白表達

2.3 去鐵胺預處理逆轉甲基汞致PC12細胞和BRL細胞中GPx4蛋白表達降低

免疫印跡結果顯示，與對照組相比，0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組PC12細胞和BRL細胞中GPx4蛋白表達明顯降低(q=3.3、2.958，P均<0.05)；與0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組相比，50、100、200和400 μmol/L去鐵胺+甲基汞組PC12細胞GPx4蛋白表達明顯增加(q=3.614、7.879、7.296、11.50，P均<0.05)；且各濃度間GPx4蛋白表達差異均有統計學意義(P<0.05)，除外100 μmol/L去鐵胺+甲基汞組與200 μmol/L去鐵胺+甲基汞組中GPx4蛋白表達無統計學意義(P>0.05)。在BRL細胞中，400 μmol/L去鐵胺+甲基汞組中GPx4蛋白表達較0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組明顯增加(q=3.390，P<0.05)。見圖3。

2.4 去鐵胺預處理逆轉甲基汞致PC12細胞和BRL細胞中HIF-1α蛋白表達降低

免疫印跡結果顯示，與對照組相比，0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組PC12細胞和BRL細胞中HIF-1α蛋白表達明顯降低(q=2.932、3.044，P均<0.05)。與0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組相比，50、100、200和400 μmol/L去鐵胺+甲基汞組PC12細胞中HIF-1α蛋白表達均明顯增加(P均<0.05)；與50 μmol/L去鐵胺+甲基汞組相比，400 μmol/L去鐵胺+甲基汞組中HIF-1α蛋白表達明顯增加(q=3.900，P<0.05)。100、200和400 μmol/L去鐵胺+甲基汞組BRL細胞中HIF-1α蛋白表達明顯高于0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組(q=2.819、2.908、3.389，P均<0.05)。見圖4。

a:P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較；c：P<0.05，與50 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較；d：P<0.05，與100 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較；e：P<0.05，與200 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較圖3 免疫印跡法檢測不同濃度去鐵胺預處理后細胞中GPx4蛋白表達

a:P<0.05，與對照組比較，b:P<0.05，與0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較；c:P<0.05，與50 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較；圖4 免疫印跡法檢測不同濃度去鐵胺預處理后細胞中HIF-1α蛋白表達

2.5 去鐵胺預處理逆轉甲基汞致PC12細胞和BRL細胞活力降低

與對照組相比，0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組中PC12細胞和BRL細胞活力明顯降低(q=8.675、5.30，P均<0.05)。與0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組相比，400 μmol/L去鐵胺+甲基汞組PC12細胞活力明顯增加(q=3.607，P<0.05)，200 μmol/L去鐵胺+甲基汞組BRL細胞活力明顯增加(q=2.781，P<0.05)。見圖5。

a:P<0.05，與對照組比較，b:P<0.05，與0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較圖5 MTT法檢測不同濃度去鐵胺預處理后細胞活性變化

3 討論

本研究采用神經元樣PC12作為神經元模型，利用大鼠肝BRL細胞作為非神經元模型。實驗結果表明，甲基汞濃度為5.0和10.0 μmol/L時，PC12細胞活力明顯降低，甲基汞濃度為10.0 μmol/L時，BRL細胞活力明顯降低，表明神經元細胞模型可能對甲基汞毒性更加敏感，這與Miura等[16]發現相一致，其機制可能與汞更容易蓄積于中樞神經系統[17]，也可能與肝臟系統較強大的排泄作用及促進甲基汞的去甲基化作用有關[18]。已有研究發現多種藥物和化學毒物毒性機制涉及鐵死亡，例如，鐵死亡在鋁致神經元死亡中起到重要作用，其機制主要涉及谷胱甘肽表達下調及活性氧生成[14]。甲基汞毒性主要與谷胱甘肽的耗竭、活性氧的生成等進而造成機體氧化應激損傷有關，且該損傷可能由Fe2+所介導[12]。GPx4作為調控氧化應激損傷的重要調控因子，亦是鐵死亡的關鍵調控基因，并且對神經組織平衡的維持具有重要作用[19]。中樞神經是甲基汞最重要的靶器官，但甲基汞的細胞毒性是否與調控GPx4表達進而誘導鐵死亡相關仍不明確。在本實驗中，甲基汞濃度為2.5 μmol/L時，PC12細胞中GPx4蛋白表達明顯降低；在BRL細胞中，甲基汞濃度為5 μmol/L 時，GPx4蛋白表達降低。PC12細胞中GPx4蛋白對甲基汞濃度更加敏感，可能與肝臟具有較強大的抗氧化應激損傷有關，也提示PC12細胞對甲基汞毒性更加敏感的機制可能與甲基汞作用后GPx4蛋白下降更明顯有關，同時提示甲基汞的毒性可能與其誘導鐵死亡相關。

去鐵胺作為一種傳統的鐵螯合劑，在麥芽酚鋁致PC12細胞鐵死亡中起重要拮抗作用，其機制可能與去鐵胺降低細胞內鐵離子含量和增加細胞抗氧化損傷能力而抑制鐵死亡有關[14]。本實驗中選用不同濃度去鐵胺進行預處理后，在PC12細胞和BRL細胞中，去鐵胺濃度分別為400、200 μmol/L時可以拮抗甲基汞的毒性，一方面表明去鐵胺為一種有效的化學毒物致損傷的拮抗劑，另一方面表明在神經元細胞中拮抗甲基汞毒性需要較高濃度的去鐵胺，說明甲基汞致神經細胞損傷后可能較難逆轉。GPx4蛋白表達下降是鐵死亡發生的關鍵事件之一，在急性腎衰模型中，利用鐵螯合劑上調GPx4蛋白可以抑制鐵死亡誘導劑所致的細胞死亡[19]。去鐵胺作為一種鐵死亡拮抗劑，能夠減輕氧化應激損傷，增加多巴胺活性，從而改善運動神經癥狀。本研究發現，去鐵胺預處理后，除200 μmol/L與100 μmol/L比較GPx4蛋白表達增加無統計學意義外，其他濃度組間GPx4蛋白表達差異均有統計學意義，表明在50～100 μmol/L以及200～400 μmol/L范圍內呈一定的濃度依賴性；在BRL細胞中，僅400 μmol/L去鐵胺處理時GPx4表達增加，未呈一定的濃度依賴性，一方面提示去鐵胺拮抗甲基汞毒性可能與增加GPx4蛋白表達進而抑制鐵死亡有關，另一方面提示GPx4蛋白表達增加在去鐵胺拮抗甲基汞致神經細胞損傷中更為敏感，且在一定濃度范圍內呈一定的劑量依賴性。

在氧化應激的體外模型中，鐵螯合劑的保護作用與激活HIF-1相關，且調控HIF-1α降解的關鍵酶——脯氨酸羥化酶的抑制劑在拮抗鐵死亡方面亦起重要作用[20]，去鐵胺作為鐵離子螯合劑，一方面可以抑制鐵死亡，另一方面可以抑制HIF-1α降解。本實驗發現50、100、200和400 μmol/L去鐵胺作用后，PC12細胞中HIF-1α表達增加，且400 μmol/L去鐵胺預處理后HIF-1α表達較50 μmol/L顯著增加；在BRL細胞中，100、200和400 μmol/L預處理后HIF-1α表達增加。一方面表明HIF-1α上調在去鐵胺拮抗甲基汞致鐵死亡中可能亦存在著重要作用；另一方面，甲基汞毒性與其損傷線粒體造成機體氧氣利用障礙有關，PC12細胞作為神經元，對氧濃度更為敏感[21]，因此去鐵胺濃度較低時，PC12細胞中HIF-1α表達上調，以更好地拮抗甲基汞致神經元因氧氣利用障礙造成的損傷。

目前關于甲基汞的毒性與鐵死亡間關系的研究仍不完善，需要增加一些新的指標，如谷胱甘肽含量測定，細胞內鐵離子測定等。同時，雖然本研究表明去鐵胺可以通過上調HIF-1α及GPx4起到拮抗甲基汞的毒性作用，但HIF-1α與GPx4的關系亦未完全確定，尚需進一步研究。

綜上所述，甲基汞毒性可能與其誘導鐵死亡相關，去鐵胺作為一種鐵螯合劑，具有拮抗甲基汞毒性的效應，其機制可能與上調HIF-1α及GPx4從而抑制鐵死亡有關。