腎透明細胞癌組織VEPH1表達降低并與不良預后相關

胥傳海，蘭建云，徐林成，李蕾，周林森

(鹽城市第一人民醫院 1.病理科；2.普外科，江蘇 鹽城 224500)

腎透明細胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤，約占腎癌的85%，腎細胞癌在我國發病率居泌尿系惡性腫瘤第2位[1]。最新研究顯示腫瘤的發生和進展與細胞的代謝紊亂息息相關，糖和脂肪的代謝異常在KIRC中發揮關鍵作用[2-3]。

心室區表達PH域的蛋白質同源物1(ventricular zone-expressed PH domain-containing protein homo-log 1，VEPH1)基因于2000年首次在人胚胎腦組織中發現，在人腎臟、胰腺、脾臟和胚胎腦組織中高表達[2,4-5]。既往研究發現，VEPH1定位于蛋白羧基端的結構域是一種常見的蛋白組件，存在于200多種信號傳導蛋白及細胞骨架蛋白中。VEPH1參與蛋白質—脂質、蛋白質—蛋白質之間的相互作用，影響胞內物質運輸和定位，參與信號傳導和細胞骨架的構成[6]。本研究應用癌癥基因組圖譜(The Can-cer Genome Atlas,TCGA)數據庫和人類蛋白質圖集(The Human Protein Atlas,HPA)數據庫探討VEPH1基因與KIRC患者預后的關系及其潛在的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 VEPH1基因表達差異及其與KIRC預后關系分析

GEPIA(http:∥gepia.Cancer-pku.cn/index.Html)是由北京大學開發的交互式web服務器。在TCGA的KIRC數據中檢索VEPH1，主要分析條件如下，“Expression DIY”模塊：Boxplot中選擇“VEPH1”、“KIRC”及“Match TCGA normal and GTEx data”。選擇“Survival”模塊：Survival Plots中選擇“VEPH1”、“Overall Survival”及“KIRC”，進行Mantel-Cox檢驗分析，并導出總生存曲線圖。基于該數據庫的測序數據，統計分析VEPH1基因在腫瘤組織與癌旁組織中的表達差異，VEPH1在正常腎組織和KIRC組織中的表達差異，VEPH1基因與KIRC預后的相關性。R3.6.2軟件設計配對t檢驗函數，比較100例患者腫瘤和癌旁組織中VEPH1基因的表達量是否有顯著差異。

1.2 VEPH1基因與KIRC患者預后關系的分析

TCGA數據庫下載整理530例KIRC的基因表達數據和臨床數據，使用R3.6.2版本軟件的“survival”包分析，單因素分析各臨床指標與患者生存是否相關。

1.3 VEPH1蛋白在腫瘤和癌旁組織表達分析

從HPA數據庫下載3例正常腎臟組織和10例KIRC組織VEPH1免疫組化結果(抗體編號:HPA026645)，分析VEPH1蛋白的表達。

1.4 Cbioportal數據庫分析VEPH1在KIRC組織中表達降低的原因

利用Cbioportal(https:∥www.cbioportal.org/)網站，搜索VEPH1基因在TCGA數據庫448例KIRC患者腫瘤組織中的錯譯率與突變率(篩選條件：Kidney Renal Clear Cell Carcinoma,TCGA,Firehose Legacy)。

1.5 基因集富集分析(GSEA)分析VEPH1基因在KIRC中主要參與的通路

根據TCGA數據集538例KIRC患者基因表達譜數據，運用GSEA軟件分析VEPH1表達水平與京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路基因集的相關。在GSEA中，使用h.all.v7.1.symbols.gmt c2.作為參照基因集，將P<0.05及錯誤發現率(false discovery rates,FDR)<0.25的基因集作為顯著富集的基因集。

2 結果

2.1 VEPH1在KIRC腫瘤與癌旁組織中的表達差異

利用GEPIA平臺泛腫瘤分析發現，VEPH1mRNA在人體正常器官組織中廣泛表達，但是，在KIRC中，VEPH1在腫瘤組織與癌旁組織中表達差異最大(圖1A)。TCGA數據庫523例KIRC腫瘤組織與100例癌旁組織VEPH1mRNA表達的分析結果顯示，KIRC腫瘤中VEPH1mRNA表達水平顯著低于癌旁組織(t=12.64，P<0.05)，見圖1B。配對比較100例KIRC患者腫瘤與癌旁組織中VEPH1mRNA表達，結果顯示VEPH1mRNA在腫瘤組織中明顯降低(圖1C)。

2.2 VEPH1在KIRC腫瘤和癌旁組織中的蛋白表達

從HPA數據庫下載3例正常腎組織和10例KIRC腫瘤組織VEPH1免疫組化結果，VEPH1蛋白在正常腎組織中普遍呈高表達(圖2)，而10例KIRC腫瘤組織中2例呈高表達，6例呈中表達，2例呈低表達，且主要定位于核質，呈棕褐色。KIRC腫瘤中VEPH1在mRNA水平和蛋白水平的表達相對一致，且均較正常腎組織呈現表達下調。

A：GEPIA平臺泛腫瘤分析；B：KIRC腫瘤組織中VEPH1 mRNA表達量顯著低于癌旁組織；C：配對比較100例KIRC患者腫瘤組織與癌旁組織VEPH1 mRNA表達圖1 生物信息學分析VEPH1基因在KIRC與癌旁組織中的表達

圖2 VEPH1蛋白在正常腎組織(左圖)和KIRC組織(右圖)中的表達

2.3 VEPH1低表達與KIRC患者預后相關

GEPIA網站分析VEPH1mRNA表達與患者生存期長短的相關性(圖3)，結果顯示KIRC腫瘤中的VEPH1表達越低，患者生存期越短(P<0.05)。單因素COX回歸分析提示KIRC患者預后與年齡、淋巴結受累、VEPH1mRNA表達均顯著相關(表1)。

表1 KIRC患者生存預后與臨床病理參數和VEPH1表達的關系

圖3 VEPH1 mRNA表達與KIRC患者生存期的關系

2.4 VEPH1 mRNA低表達原因分析

登錄Cbioportal網站，搜索VEPH1基因在TCGA數據庫448例KIRC患者腫瘤組織中的錯譯率與突變率，僅出現2例錯譯與突變，擴增的概率僅為1.1%(圖4)。VEPH1mRNA在KIRC腫瘤中表達降低的原因，推測主要是與腫瘤環境改變有關，而不是與基因的錯譯或者突變有關。

A：448例患者僅有2例發生錯譯與突變；B：僅有1.1%的患者發生基因擴增圖4 TCGA數據庫448例KIRC患者基因突變測序分析

2.5 VEPH1功能富集分析

分子標簽數據庫選擇c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt[Curated]數據庫，高表達VEPH1的KIRC樣本中，在多種代謝相關的通路上顯著富集，包括丙酮酸代謝，色氨酸、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等多種重要的氨基酸代謝，以及淀粉、蔗糖和三酰甘油代謝(圖5)。根據標準化P值判斷，與代謝通路相關顯著的所有基因集名稱具體見表2。

圖5 GSEA數據庫分析VEPH1高表達相關基因集的富集

表2 GSEA分析VEPH1高表達富集的相關通路統計

3 討論

本研究分析VEPH1在TCGA數據庫中的測序信息以及患者臨床信息，首次發現VEPH1在KIRC組織中mRNA和蛋白水平均較正常腎組織表達量顯著降低；腫瘤組織中VEPH1mRNA高表達KIRC患者生存期顯著高于低表達的患者。大樣本統計腫瘤中VEPH1測序結果，VEPH1mRNA在腫瘤組織中只有極少數是錯譯和突變，另外僅存在1.1%的基因擴增。GSEA功能富集分析表明，VEPH1在KIRC腫瘤中高表達相關基因集主要富集在多種代謝通路中。因此，推測VEPH1在腫瘤中低表達，可能是與多種重要的氨基酸、糖類以及三酰甘油代謝通路活動降低相關，這些代謝活動減弱導致患者預后差，生存期顯著低于高表達患者。因此，VEPH1具有作為KIRC病理診斷標志物的潛在價值。

GSEA分析結果顯示，VEPH1在KIRC組織中的表達量與丙酮酸代謝及色氨酸、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等多種重要的氨基酸代謝有關，提示VEPH1與色氨酸及丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝通路有關，以及淀粉、蔗糖和三酰甘油代謝相關[7-8]。有研究顯示，腫瘤細胞在有氧條件下，同時存在無氧酵解，共同提供自身需要的代謝及增殖需要的能量[9]。GSEA分析顯示VEPH1高表達富集在三酰甘油通路，患者VEPH1高表達時，可能是由于三酰甘油代謝較低表達患者好，因此預后比低表達患者好[10]。VEPH1在KIRC組織中的表達量與丙酮酸相關，而丙酮酸濃度的改變可作為糖的有氧氧化和無氧酵解的分界點，丙酮酸代謝下降時，胞內丙酮酸的濃度升高，為KIRC腫瘤細胞的無氧酵解提供了豐富的前體物質[11-12]。腎癌患者血清中谷氨酸濃度較健康者升高，谷氨酰胺的濃度降低，可能是由于腎癌患者VEPH1表達普遍降低，與VEPH1相關的谷氨酸代謝降低相關[13]。VEPH1高表達腎癌患者的預后要好于低表達患者，推測是由于谷氨酸和谷氨酰胺濃度的增加促進了谷胱甘肽的生成，提高了癌細胞的抗氧化能力，因此可能影響患者的預后[14]。越來越多的研究表明，代謝通路的異常與腎癌尤其是KIRC患者預后的關系極為密切[15]。

綜上所述，本研究通過生物信息學方法揭示了VEPH1可能參與KIRC的發生、發展，并具有作為KIRC診斷標志物、預后指標及治療靶點的潛在應用價值。但VEPH1在KIRC中的作用及其機制還有待后續實驗予以證實及豐富。