仙臺病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

黃宗文 王 吉 馬 宏

(1.北京理工大學,北京 100081)(2.中國食品藥品檢定研究院,北京 102629)

仙臺病毒(Sendai virus,SeV)在病毒分類上屬于副黏病毒科、呼吸道病毒屬病毒,病毒核酸為單股負鏈 RNA,基因組長度 15 384個核苷酸[1-2]。1953年在日本仙臺首次發現,命名為Fushimi株[3]。仙臺病毒可引起嚙齒類動物呼吸系統疾病,感染仙臺病毒的動物免疫系統會受到影響,可能影響藥效學實驗結果,且被仙臺病毒感染的動物群很難凈化[4-6]。

現行實驗動物微生物等級國家標準對大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠清潔級及以上等級,必檢項目中均含有仙臺病毒[7],但ELISA存在檢測耗時較長,包被抗原較難制備,需要免疫動物制備陽性血清等問題[8]。

實時熒光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)方法有靈敏度較高、直接檢測病毒核酸并可以對核酸濃度定量檢測等優點[9]。本研究建立了特異的SeV實時熒光定量PCR檢測方法,能夠快捷、準確地檢測樣本中仙臺病毒的核酸含量。

裸鼴鼠具有抗衰老、耐低氧、耐疼痛等方面的特性,目前廣泛用于腦神經、抗氧化、腫瘤等方面的研究。本文應用建立的方法對裸鼴鼠SeV進行了攜帶情況篩查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及樣品:仙臺病毒、小鼠肝炎病毒(MHV-V1)、呼腸孤病毒3型(Reo3)、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV),中國食品藥品檢定研究院實驗動物質量檢測室保存;小鼠肺炎病毒(PVM),美國ATCC(編號:VR-25);40只SPF小鼠,國內某單位送檢;4只屏障環境飼養黃鼠樣本,國內某單位送檢;5只6周齡清潔級小鼠,國內某單位送檢;58份裸鼴鼠樣本,中國人民解放軍第二軍醫大學。

1.1.2 主要儀器與試劑:熒光定量 PCR儀(7500 fast Real-Time PCR System),ABI公司;逆轉錄試劑盒,AMV Reverse Transcriptase,購自 Promega公司;RNA提取試劑盒,購自 QIAGEN公司;SYBR?Premix Ex TaqTMGC,TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計:將不同株仙臺病毒序列進行比對,發現一段保守序列,位于RNA polymerase protein基因,序列號:NC_001552.1(8 556～15 242),對此保守序列設計引物。序列見表1。

表1 引物序列Table 1 The sequences of primers

人工合成SeV基因組12 181～12 480 DNA序列,轉入pMD19-T質粒中,作為SeV質粒標準品。

1.2.2 病毒 RNA提取、逆轉錄:對正常雞胚尿囊液、SeV 感染雞胚尿囊液、Reo3、PVM、MHV、LCMV,進行RNA提取操作,以提取的 RNA為模板,用AMV Reverse Transcriptase試劑盒逆轉錄獲得cDNA。

1.2.3 實時熒光定量PCR擴增體系及標準曲線的建立:用含有目的片段的質粒pGEM-T Easy-pol作為標準品,按 109～100copies/μL梯度稀釋,作為進行實時熒光定量PCR反應的模板,建立標準曲線。擴增體系如下:Premix 10μL,引物1μL,待檢測模板1μL,RNase-free Water 8μL,體系 20μL。 擴增條件為:每個循環 50℃2 min,95℃10 min,95℃15 s,60℃1 m in,擴增40個循環。

1.2.4 特異性實驗:以 SeV、Reo3、PVM、MHV、LCMV及雞胚尿囊液陰性對照為擴增模板,檢測SeV實時熒光定量PCR檢測方法的特異性。

1.2.5 最低檢出限實驗:以109～100copies/μL 質粒標準品為模板,進行實時熒光定量PCR擴增,每個濃度標準品各做3個平行。擴增反應循環閾值(Ct)≤35,拷貝數(copies)≥10時,對應的最低模板濃度為方法的最低檢出限。

1.2.6 重復性和穩定性實驗:以 107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL 3個不同濃度陽性質粒標準品為模板,擴增3次,計算批間變異系數。

1.2.7 實時熒光定量PCR方法的應用

1.2.7.1 用建立的Q-PCR方法對40只SPF小鼠、4只黃鼠、5只清潔級小鼠、58只裸鼴鼠肺組織檢測,同時設 109～105copies/μL質粒標準品對照。按1.2.4擴增體系和條件擴增。

1.2.7.2 判斷標準的確定

擴增效率Eff%在90%～110%之間,建立的標準曲線相關系數R2＞0.99,實驗成立。

樣品同時滿足循環閾值(Ct)≤35,拷貝數(copies)≥10,判定為陽性。其余情況判定為陰性。

1.2.8 動物樣本ELISA方法檢測:以國家標準中ELISA方法對40只SPF小鼠、4只黃鼠、5只清潔級小鼠、58只裸鼴鼠血清檢測[8]。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR擴增體系及標準曲線的建立

以質粒標準品作為模板,進行擴增反應,模板濃度為 1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103copies/μL,擴增曲線見圖 1,擴增效率 Eff%為99.362%,標準曲線(圖2)相關系數R2值為0.999。

圖1 1×107～1×103copies/μL標準品擴增曲線Fig.1 The am p lification curve of 1×107—1×103copies/μL standard

圖2 1×107～1×103copies/μL標準品標準曲線Fig.2 The standard curve of 1×107—1×103copies/μL standard

2.2 方法特異性驗證

實時熒光定量PCR檢測方法特異性檢測,分別以 SeV、Reo3、PVM、MHV、LCMV、正常雞胚尿囊液的cDNA為模板進行擴增,結果如圖3所示,可以看出以SeV的 cDNA為模板擴增曲線明顯,而以Reo3、PVM、MHV、LCMV、雞胚尿囊液的 cDNA 為模板,則無擴增。顯示該方法可對仙臺病毒特異檢測。

圖3 SeVQ-PCR特異性檢測結果注:1:SeV;2～7:Reo3、PVM、MHV、LCMV、正常雞胚尿囊液Fig.3 Specifictesting results of SeVQ-PCRNote:1:SeV;2-7:Reo3、PVM、MHV、LCMV、normal chick embryo allantoic fluid

2.3 方法穩定性和重復性驗證

檢測質粒標準品 3個濃度對應的 Ct、標準差(CtSD)及變異系數見表2。各質粒標準品濃度3次檢測結果Ct的變異系數＜5%,說明該方法穩定、可重復。

表2 熒光定量PCR檢測方法的重復性和穩定性試驗結果Table 2 The repeatability and stability testing results of Q-PCR

2.4 最低檢測限度結果

如圖 4、圖 5所示,標準曲線擴增效率為100.644%、相關系數R2值為0.994。質粒標準品模板濃度為10 copies/μL時仍有曲線擴增,Ct為34.031,該方法檢測結果為10.653 copies/μL,偏差較小;可認為最低檢測限度為10 copies/μL。

圖4 1×109～1×100copies/μL標準品的標準曲線Fig.4 The standard curve of 1×109—1×100cop ies/μL standard

圖5 1×109～1×100copies/μL標準品擴增曲線Fig.5 The am p lification curve of 1×109—1×100copies/μL standard

2.5 實時熒光定量PCR方法的應用

2.5.1 SPF小鼠檢測結果:將該方法用于40只SPF小鼠的肺組織樣本的檢測,得到擴增曲線(圖 6)。

圖6 40只SPF小鼠擴增曲線Fig.6 The amplification curve of 40 SPF mice

經過熒光定量PCR檢測,40只SPF小鼠肺組織樣本的循環域值(Ct＞35)和拷貝數(copies＜10)均在檢測限之外,判定上述樣本為陰性。

2.5.2 黃鼠檢測結果:將所建立的實時熒光定量PCR方法用于4份黃鼠的肺組織樣本的檢測,標準品為109～102copies/μL,得到擴增曲線(圖7),陽性率為 100%(表 3)。

圖7 黃鼠擴增曲線Fig.7 The amplification curve of Sperm ophilus dauricus

表3 黃鼠檢測結果Table 3 The testing resu lts of Sperm ophilus dauricus

2.5.3 清潔級小鼠檢測結果:將所建立的實時熒光定量PCR方法用于5只清潔級小鼠樣本的檢測,標準品為109～102copies/μL,得到擴增曲線(圖 8),陽性率為100%(表4)。

圖8 清潔級小鼠擴增曲線Fig.8 The amplification curve of clean mice

2.5.4 裸鼴鼠檢測結果:將所建立的實時熒光定量PCR方法用于58只裸鼴鼠的肺組織樣本的檢測,得到擴增曲線(圖9)。

表4 清潔級小鼠檢測結果Table 4 The testing results of clean mice

圖9 裸鼴鼠擴增曲線Fig.9 The amplification curve of naked molerats

經過熒光定量PCR檢測,58份裸鼴鼠肺組織樣本的循環域值(Ct＞35)和拷貝數(copies＜10)均在檢測限之外,判定上述樣本為陰性。

2.6 ELISA方法檢測結果

檢測樣本信息及結果見表5。

表5 ELISA方法檢測結果Table 5 The testing results of ELISA method

3 討論

仙臺病毒在嚙齒類動物中廣泛傳播,并引起動物支氣管肺炎。在小鼠中有些情況引起臨床反應,有的為隱形感染,這和宿主有關,比如小鼠暴露的年齡或小鼠品系對仙臺病毒感染的敏感性[10-11]。另外,仙臺病毒的不同毒株對小鼠致病性也不同。同時仙臺病毒還是人獸共患病原,對人具有感染性,引起人的肺炎等呼吸道疾病[5]。因此,仙臺病毒是鼠源性生物制品及其生產原材料外源病毒必須排除項目[12]。

從ELISA抗體檢測結果和本文建立的Q-PCR方法檢測結果可知,40只SPF小鼠和58只裸鼴鼠檢測結果一致,均為陰性,說明送檢動物確實無SeV感染。5只清潔級小鼠經ELISA檢測陽性率為40%,說明送檢小鼠確實存在SV的感染,同時也說明Q-PCR方法可以彌補因抗體在動物體內存在的差異性而導致的ELISA抗體檢測方法漏檢,也進一步證明建立的方法可以用于動物是否攜帶SeV的檢測。4只屏障飼養的黃鼠經ELISA抗體檢測結果均為陰性,經Q-PCR檢測結果均為陽性。分析其原因:①送檢黃鼠經背景調查來源為野生,且為成年黃鼠,因此在屏障環境飼養前可能就已感染SeV;②由于抗原抗體在動物體內存在的差異性,動物體內可能一直攜帶病毒,但抗體水平已經下降,抗體檢測結果可能會為陰性。現在國內對仙臺病毒檢測主要為ELISA方法,通過檢測血清中仙臺病毒抗體間接反映病毒感染情況,存在步驟煩瑣、耗時長、不能反映實時病毒感染狀態等缺點,且藥典關于“鼠源性病毒檢查法”中仙臺病毒的檢測方法也僅局限于動物抗體產生、細胞接種和雞胚接種等方法[12]同樣存在檢測周期長、敏感性低等特點。本文建立的熒光定量PCR方法操作快捷、靈敏、特異[13-18],可以定量檢測樣本病毒拷貝數[19-22],不僅可以用于動物的檢測及反映動物感染狀態,同時可以用于動物源性生物制品或生產原材料外源仙臺病毒因子的檢測,為用藥安全提供保障。

目前市場上商品化SeV核酸檢測商品化試劑匱乏。因此本實驗建立的方法,不僅可以開展對小鼠、黃鼠、裸鼴鼠等動物及鼠源生物制品外源 SeV的檢測,為保證實驗小鼠、黃鼠、裸鼴鼠等實驗動物使用安全性及為實驗動物標準化研究提供依據,同時也為試劑盒的研制奠定了基礎。