褐藻酸降解菌生長及產(chǎn)酶條件研究

董硯博

摘要：為確定褐藻酸降解菌的最佳生長及產(chǎn)酶條件，以菌株AGN12為研究對象，根據(jù)發(fā)酵液的生物量和上清液的酶活力，分析碳源、氮源、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始PH值、培養(yǎng)溫度對酶解效果的影響。試驗確定的最佳產(chǎn)酶條件為：以0.7%海藻酸鈉為碳源，以0.3%硫酸銨為氮源，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)基初始pH值8.0，培養(yǎng)時間24 h。

關鍵詞：降解菌;褐藻酸;試驗;寡糖;酶活力

中圖分類號：Q93-335 ? ?文獻標識碼：A ? ?文章編號：1674-1161（2020）06-0050-03

海帶是我國產(chǎn)量最高的海藻類生物，富含褐藻酸鹽（alginate）類多糖聚合物。褐藻酸降解菌能分泌褐藻酸酶，使褐藻酸多糖轉(zhuǎn)化為具有多種生物活性的寡聚糖，誘導植物產(chǎn)生抗性反應并增強抵抗力。為此，從腐爛的海帶汁中篩選和分離得到菌株AGN12，利用其體內(nèi)的酶水解褐藻酸鹽，采用單因素試驗研究其生長條件和產(chǎn)酶條件，旨在為利用酶法降解褐藻酸多糖生成有活性的寡糖提供工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

將新鮮海帶破碎后，置于三角瓶中發(fā)酵數(shù)天，得腐爛海帶汁，通過發(fā)酵、富集、培養(yǎng)、選擇、分離得到AGN12菌。

碳源為褐藻酸，產(chǎn)自上海埃彼化學試劑有限公司;氮源為蛋白胨和酵母浸粉，產(chǎn)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司;硫酸銨產(chǎn)自上海埃彼化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HZQ-F 全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司;HPX-9082ME數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;722-分光光度計：上海精密科學儀器有限公司;TDA-8002 恒溫水浴鍋：余姚市肖東儀器廠;TGL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同碳源對生長和產(chǎn)酶的影響 在基礎培養(yǎng)基的基礎上調(diào)整碳源，即分別添加濃度均為0.6%的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、海藻酸、微晶纖維素、果糖、甘露糖和山梨糖，配制含有不同含碳化合物的培養(yǎng)基。然后按3%的接種量接入菌液，于30 ℃液體培養(yǎng)16 h后，測定發(fā)酵液的生物量和上清液的酶活力。

1.3.2 不同氮源對生長和產(chǎn)酶的影響 在含0.6%褐藻酸基礎培養(yǎng)基的基礎上調(diào)整氮源，分別添加濃度均為0.2%的酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、酪蛋白水解物、硝酸銨和硫酸銨，配制含有不同含氮化合物的培養(yǎng)基。按3%的接種量接入菌液，于30 ℃液體培養(yǎng)16 h后，測定發(fā)酵液的生物量和上清液酶活力。

1.3.3 培養(yǎng)溫度對生長和產(chǎn)酶的影響 按3%的接種量接入基礎培養(yǎng)基中，分別在20，25，30，35 ℃下液體培養(yǎng)16 h，測定發(fā)酵液的生物量和上清液酶活力。

1.3.4 培養(yǎng)基初始pH值對生長和產(chǎn)酶的影響 將生長基礎培養(yǎng)基的起始pH分別調(diào)至3.0，5.0，7.0，8.0，9.0，11.0。然后按3%的接種量接入菌液，30 ℃液體培養(yǎng)16 h，測定發(fā)酵液的生物量并測定上清液的酶活力。

1.3.5 培養(yǎng)時間對生長和產(chǎn)酶的影響 在上述最佳產(chǎn)酶條件下，按3%的接種量培養(yǎng)菌體，前24 h內(nèi)每隔2 h取樣，24 h后每隔12 h取樣，測定發(fā)酵液的生物量和酶活，確定最佳發(fā)酵時間。

2 結果與討論

2.1 不同碳源對生長及產(chǎn)酶的影響

不同碳源對AGN12菌生長及產(chǎn)酶的影響見表1。

由表1可知：AGN12菌對不同碳源的利用有很大差別，以海藻酸作為碳源時，菌體生長最好，酶活力最高，即產(chǎn)酶量最高;用酵母浸粉、甘露糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖做碳源時，菌體生長緩慢，產(chǎn)酶量也較低，說明AGN12菌對這幾種碳源的利用效果不好;以山梨糖、CMC、可溶性淀粉、蔗糖為碳源時，菌體不生長，也檢測不到酶活。由此可以得出結論，海藻酸鈉是最佳碳源。

2.2 不同氮源對生長及產(chǎn)酶的影響

不同氮源對AGN12菌生長及產(chǎn)酶的影響見表2。

由表2可見：在含有機氮源牛肉膏、胰蛋白胨、酪蛋白水解物的培養(yǎng)基中，AGN12菌能迅速生長并具有較高的產(chǎn)酶能力;在含蛋白胨、酵母浸粉的培養(yǎng)基中，AGN12菌也能迅速生長并具有一定的產(chǎn)酶能力;在含有無機氮源硫酸銨、硝酸銨的培養(yǎng)基中，AGN12菌的生長情況不及含有機氮源的培養(yǎng)基，但以硫銨為氮源時，AGN12菌具有很高的產(chǎn)酶能力。從空白來看，AGN12菌在不含任何氮源的培養(yǎng)基中能迅速生長并有較高的產(chǎn)酶能力。將空白與含有機氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)酶情況相比較，發(fā)現(xiàn)部分有機氮源抑制菌產(chǎn)酶。

2.3 培養(yǎng)溫度對生長和產(chǎn)酶的影響

受試驗條件限制，僅選擇20，25，30，35 ℃共4個溫度進行試驗，結果見圖1。

由圖1可知，從20 ℃開始，隨著溫度的升高，細菌生長情況良好，酶活不斷增強。測裂解酶酶活即粘度發(fā)現(xiàn)，20 ℃和25 ℃的產(chǎn)酶情況相差不大，而另一酶活指標還原糖生成量隨溫度升高不斷升高;30 ℃是生長和產(chǎn)酶的最佳溫度，菌體生長迅速，生物量和產(chǎn)酶量達到最高。但溫度升高到35 ℃時，菌開始停止生長。

2.4 培養(yǎng)基初始pH值對生長和產(chǎn)酶的影響

將培養(yǎng)基的初始pH調(diào)整為3.0，5.0，7.0，8.0，9.0，11.0，初始pH值對生長和產(chǎn)酶的影響見圖2。

由圖2可以看出：在pH 8.0的培養(yǎng)基中，菌體長最好，產(chǎn)酶量最高，其次為pH 7.0的培養(yǎng)基。由此確定培養(yǎng)基最適初始pH值為8.0。

2.5 培養(yǎng)時間對生長和產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)時間對生長和產(chǎn)酶的影響見圖3。

在前6 h里，菌體處于延滯期;6～22 h，菌體生長迅速，表明菌體處在對數(shù)期，并在24 h時菌體濃度達最大值，OD600為1.004（稀釋二倍）;此后，菌體生長變慢，處于穩(wěn)定期;在26 h后菌體開始自溶，濃度不斷下降。

從還原糖濃度變化來看：發(fā)酵液中的酶活力逐漸升高，在24 h達到最高;此后菌體量開始下降，酶活力在24～72 h之間呈穩(wěn)定狀態(tài)，72 h后呈現(xiàn)下降趨勢。故24 h為最佳培養(yǎng)時間。

3 結論

以菌株AGN12為試驗對象，以碳源、氮源、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度等為因素，研究褐藻酸降解菌的最佳生長及產(chǎn)酶條件。通過單因素試驗確定AGN12菌生長及產(chǎn)酶的最佳條件為：以0.7%海藻酸鈉為碳源，以0.3%硫酸銨為氮源，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)基初始pH值8.0，培養(yǎng)時間24 h。

參考文獻

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