線粒體鈣離子調控腫瘤發展的作用及機制研究進展

陶雪，魏立彬，郭青龍

（江蘇省南京市鼓樓區童家巷24 號中國藥科大學玄武門校區，江蘇省腫瘤發生與干預重點實驗室，江蘇 南京）

0 引言

線粒體是細胞的能量工廠，能夠合成大量的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）為細胞供能，其提供的能量約占細胞生命活動所需總能量的95%[1]。除此以外，線粒體還參與了細胞凋亡、細胞周期調控等一系列的細胞生物過程[2]。線粒體是具有雙層膜的鈣存儲細胞器，鈣離子（calcium ion，Ca2+）分布在其膜間隙和基質中[3]。Ca2+通過線粒體上不同的轉運機制穿梭于線粒體與細胞質之間，調節線粒體乃至整個細胞的生命活動。

Ca2+是機體內一種不可或缺的物質，既是細胞的第二信使，又與細胞增殖、細胞程序性死亡、肌肉刺激收縮、基因轉錄、信號傳遞等密切相關，在細胞各功能的正常運作中必不可少[4]。而細胞內Ca2+的水平依賴于內質網Ca2+的釋放和細胞外空間Ca2+的流入。在正常情況下，維持一定水平的Ca2+可促進細胞存活。

Ca2+穩態的異常是許多疾病的共同病理機制之一。研究表明，Ca2+不但能被線粒體攝取和釋放，而且線粒體對Ca2+的攝取和釋放過程在維持胞漿鈣穩態中發揮重要作用[5]。有研究報道，線粒體內游離Ca2+的濃度與其能量代謝的水平以及膜通透性的改變密切相關[6-8]；線粒體Ca2+的攝取和釋放過程也會影響細胞內的鈣信號[9]。這些鈣信號相關活動的異常與心臟病、癲癇以及神經退行性疾病等的發生發展密切相關[10-12]。

目前，惡性腫瘤已是全球范圍內最嚴重的公共問題之一，其發病率與死亡率逐年升高，躍居各類疾病死因的第一位，嚴重危害人類健康。據估計到2030 年，全球可能將新增2640 萬例腫瘤患者，大約1700 萬人可能死于惡性腫瘤[13]。因此，本文就線粒體Ca2+對腫瘤細胞發展的調控作用及分子機制進行綜述，為以線粒體Ca2+調控為靶標的腫瘤治療提供思路與基礎。

1 線粒體Ca2+的調控

線粒體是第一個被發現的參與Ca2+轉運的細胞器。線粒體是雙層膜的鈣存儲器，由于線粒體外膜具有Ca2+高度通透性，因此膜間隙內的Ca2+濃度與胞漿內的Ca2+濃度相當。在細胞靜息狀態下，線粒體基質內Ca2+濃度約在0～100nmol/L 之間，與胞漿內相當[14]。當細胞處于興奮狀態時，胞漿內Ca2+濃度可升到2～3μmol/L，而線粒體基質內Ca2+濃度可升至10μmol/L，甚至更高[15-16]。線粒體對Ca2+的攝取與釋放可通過單向轉運機制或轉運體進行調控。

1.1 Ca2+的攝取

20 世紀50 年代，科研人員發現離體的線粒體可以攝取Ca2+[17]。細胞中有兩個鈣池中的Ca2+可以被攝取進入線粒體：一個是細胞質中的，另一個是內質網（endoplasmic reticulum，ER）中的。

線粒體鈣單向轉運體（mitochondrial calcium uniporter，MCU）是普遍存在于線粒體內膜（inner mitochondrial membrane，IMM）中的Ca2+通道，通常被認為是相關模型中關鍵的Ca2+轉運蛋白。敲除MCU 幾乎可以完全抑制離體線粒體對Ca2+的攝取[18]。

MCU 是具有電生理特性的離子通道，通過MCU 攝取的Ca2+受電化學梯度的驅動。完整的Ca2+攝取調節復合物由MCU 和調節MCU 的相關分子共同組成。這種MCU 的調節分子包括MCU 調 節 蛋 白1（MCU regulator 1，MCUR 1）、MCU 調 節蛋白2（MCU regulator 2，MCUR 2）、線粒體鈣離子攝入蛋白1（mitochondrial calcium uptake 1，MICU1）和線粒體鈣離子攝入蛋白2（mitochondrial calcium uptake 2，MICU2）[19]等。

其中，MCUR 1 是MCU 復合物的次級子單元，其能允許離子流進入線粒體基質[20]。MCUR1 的下調可以降低Ca2+的通量，減少線粒體氧化磷酸化和ATP 的產生并激活AMPK 依賴性自噬[21]。而MCUR1 在肝癌細胞中發生上調，其表達與癌細胞的存活和腫瘤的生長密切相關。在該通路中，MCUR1 誘導了線粒體Ca2+的積累和ROS 的產生，表明MCUR1 與MCU 的結合對于功能性MCU 復合物是必需的，并且Ca2+進入線粒體是癌細胞的先決生存因子[22]。

1.2 Ca2+的釋放

線粒體內膜上存在著一種鈉鈣鋰轉運體（Na+/Ca2+Li+-permeable exchanger，NCLX），它是Na+ 依賴的鈉鈣反向交換通道，能夠正向調節線粒體內Ca2+外流。

當線粒體內Ca2+濃度過高時，會使NCLX 的活性增強，引起線粒體內膜上線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeablize transition pore，MPTP）的開放。而Ca2+是調節MPTP 孔的中樞，既可以直接調節MPTP 本身，也可通過調節ADP/ATP 的平衡、線粒體膜電位、活性氧/ 活性氮的水平以及蛋白水平對MPTP 進行調控[23]。

研究發現，MPTP 具有一個重要的性質：MPTP 開放引起的ADP 的增加和Mg2+/Ca2+的恢復均是可逆的，這種可逆性使MPTP 的開放有持續開放和瞬時開放兩種模式，可以啟動細胞的死亡信號通路或者維持細胞正常的生理功能[24]。

此外，線粒體上還存在著H+/Ca2+反向轉運通道蛋白1（leucine zipper EF hand-containing transmembrane protein 1，Letm1）。當線粒體基質中的Ca2+濃度較低時，Letm1 可轉運Ca2+進入基質；反之，則轉運Ca2+流出。研究還發現，沉默Letm1，盡管存在MCU，依然可以抑制Ca2+的內流[25]。

2 線粒體Ca2+與腫瘤細胞能量代謝

Ca2+作為第二信使幾乎參與了細胞內所有的生理活動[26]。從克雷布斯于1959 年發現Ca2+能激活磷酸激酶以來，人們認識到Ca2+是潛在的新陳代謝調節劑已經50 年了[27-29]。線粒體最初被認為是具有攝取大量Ca2+能力的“Ca2+池”，且被認為僅在胞質Ca2+超載的情況下才會發生線粒體對Ca2+的攝取作用[30]。但隨后在19 世紀60 和70 年代，人們發現生理濃度的Ca2+能調節線粒體的脫氫酶：甘油磷酸脫氫酶[31]。因此，Ca2+能刺激糖原分解和葡萄糖氧化，從而導致ATP 供應增加。

在19 世紀70 和80 年代，理查德·丹頓和吉姆·麥考馬克的研究也表明，線粒體中Ca2+活化的脫氫酶使他們提出了一種方案，其中胞質Ca2+濃度的增加被傳遞到線粒體，線粒體攝取Ca2+能夠活化基質酶，通過激活丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶刺激ATP 的產生，調節能量代謝[32-33]。這種“平行激活模型”提供了一種機制，其中Ca2+刺激了由各種激素、肌肉收縮或心臟負荷增加等生理活動引起的能量消耗過程，還提供了使細胞能夠上調ATP 供給以跟上這種能量消耗的手段[34]。

而腫瘤細胞中的代謝重編程被認為是癌癥的標志，它參與了腫瘤的生長和發展。在病程中，腫瘤細胞會發展出整體代謝適應性，使其能夠在低氧氣和養分的腫瘤微環境中生存。

因此，Ca2+影響線粒體的功能改變從而影響細胞能量代謝與腫瘤的發生發展密切相關，包括線粒體功能障礙、代謝轉為有氧糖酵解和線粒體失調[35]。目前，腫瘤細胞代謝的適應性是癌癥治療的主要限制，并且與治療藥物的耐藥性高度相關。

3 線粒體Ca2+與腫瘤細胞自噬

自噬在維持細胞穩態中發揮關鍵作用。因此，自噬失調會破壞正常生理過程，并牽涉包括癌癥在內的各種疾病的發病機理。自噬是一種細胞分解代謝途徑，在分離囊泡、自噬體和提供水解酶的溶酶體融合后，可導致蛋白質和細胞器的降解和再循環。自噬的分子過程是復雜的，涉及包括自噬相關（Atg）蛋白質在內的幾種蛋白質進行成核，延伸和融合的順序步驟[36-38]。自噬具有兩個主要的生理學作用：作為質量控制機制分解功能失調的蛋白質或細胞器，以及在營養脅迫下為了維持代謝需求而回收生物大分子[39-40]。

已有研究發現，自噬可在癌癥中發揮兩個作用：在腫瘤早期具有保護作用，而在腫瘤晚期則促進腫瘤生長。敲除小鼠的自噬基因主要是通過增加氧化應激來增加腫瘤的多樣性，這表明自噬可以防止癌癥的發展[41-42]。然而，在已確定的腫瘤中，細胞外部條件（缺氧、低養分和生長因子、活性氧、乳酸）以及致癌基因Ras 和p53 對自噬的激活維持了腫瘤細胞的存活，并且有利于腫瘤的生長[43]。另外，自噬通過調節腫瘤細胞與正常細胞之間的相互作用而在腫瘤微環境中發揮重要作用[44]。除了在腫瘤起始和腫瘤生長中起著明顯相反的作用外，自噬還與癌癥進展相關。與原發性腫瘤相比，轉移灶中自噬的標志物增加[45]，并與預后不良有關[46]。

目前研究者們認為：細胞內Ca2+是細胞自噬的潛在調節劑[47-48]，且具有“雙刃劍”的特點。

3.1 Ca2+激活自噬

一些研究表明，線粒體相關ER 膜（Mitochondrial-Associated ER Membranes，MAM）的破壞會激活自噬。MAM 是Ca2+從ER轉移到線粒體以調節線粒體酶的重要部位。Ca2+流主要通過ER膜中的IP3 受體和TRPM8 發生[49]，也通過線粒體膜上的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）、線粒體鈣單向轉運蛋白（MCU）和瞬時受體蛋白Melastatin 2（TRPM2）發生[50]。ER 和線粒體之間的Ca2+流的中斷會降低OXPHOS、誘導代謝應激并激活自噬作為生存機制[49]。然而，與正常細胞不同，腫瘤細胞中MAM 破壞引起的自噬激活似乎不足以維持所需的能量水平，從而導致腫瘤細胞死亡和腫瘤生長降低[51]。

另外，Hoyer-Hansen 等也證明了，Ca2+激動劑，如毒胡蘿卜素、ATP 和離子霉素，通過Ca2+激活的激酶CAMKK 刺激Hela 細胞自噬。該激酶可直接激活AMPK 來抑制mTOR[48]。最近，已經確定了該途徑是人神經母細胞瘤細胞中淀粉樣蛋白-β 肽誘導的自噬體形成所必需的[52]。與Ca2+對自噬的激活作用相一致，研究人員也發現線粒體裂變介導的Ca2+信號傳導顯著誘導了HCC 細胞自噬[53]。

3.2 Ca2+抑制自噬

另有一些研究小組發現Ca2+對自噬的抑制作用[54]。Khan 等發現，在雞B 淋巴細胞系中，自噬流可能受到ER 釋放的IP3R 依賴性Ca2+的負調控[55]。

目前發現Ca2+抑制自噬的途徑有以下幾種：

（1）P3R 介導Ca2+降低Beclin1 的釋放，從而減少自噬體生成，抑制自噬[56]； （2）P3R 介導Ca2+活化鈣蛋白酶，使自噬相關基因-5蛋白與自噬相關基因-12 蛋白分離，降低二者復合體水平，抑制自噬[57]；（3）ER 釋放到線粒體的Ca2+增多，使得三羧酸循環增加，ATP 生成增多，抑制自噬[58]；（4）P3R 介導Ca2+進入線粒體，導致ATP 生成增加，AMPK 被抑制，從而抑制自噬[58]。

因此，Ca2+可能對自噬具有不同的調節作用，具體可能取決于Ca2+信號傳導的時空參數、營養成分和生長因子的利用率。而細胞主要是通過自噬來對抗刺激來，因此Ca2+會影響自噬從而導致正常細胞癌變以及影響腫瘤細胞的生長。

4 線粒體Ca2+與腫瘤細胞凋亡

細胞凋亡是一種高度保守的程序性死亡過程。凋亡是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控。線粒體不僅能為細胞提供大量能量，作為細胞內的鈣庫之一也能通過調控Ca2+濃度來調節細胞的存活與死亡[59]。

對于Ca2+信號傳導調節層，其為細胞提供了極大的靈活性，使得細胞可以響應內部和外部刺激來微調細胞的生理過程。然而，這個敏感的系統可以被影響，從而在細胞中驅動惡性轉化。眾所周知，幾種類型的腫瘤細胞都經歷了其內部Ca2+信號轉導機制的廣泛重組，從而促進了腫瘤的發生[58]。

線粒體和內質網之間可通過VDAC1、IP3R 和SERCA 在內的幾種Ca2+信號蛋白進行鈣離子的交流，在腫瘤的進程中發揮著重要作用。例如，在幾種類型的非小細胞肺癌和宮頸癌中，VDAC1的表達水平與腫瘤的生長和侵襲相關[60]。最近在這方面發現，異種移植模型的細胞中，VDAC1 的遺傳破壞顯示出線粒體膜電位和ATP 含量的降低，從而導致了遷移率降低和腫瘤消退[61]。而膀胱癌細胞中IP3R1 的下調，通過減少ER- 線粒體Ca2+的攝取來防止線粒體Ca2+的超載，從而減弱順鉑介導的細胞凋亡[62]。在轉化發生的結腸上皮細胞中，SERCA3 亞型的顯著減少或丟失也證明了Ca2+信號在腫瘤發生中發生了重塑[63]。

最近發現，在幾種癌癥類型中，兩種新機制的失調會影響蛋白酶體的更新，從而通過影響IP3R3 蛋白干擾內質網-線粒體間Ca2+交流，調控腫瘤細胞的凋亡敏感性[64]。

（1）抑癌蛋白PTEN 和F-box/LRR 重復蛋白2（FBXL-2）競爭與IP3R3 的結合（后者是屬于Skip-Cullin1-F-box 蛋白家族的一種E3 泛素連接酶成分），從而減慢了FBXL-2 介導的IP3R3 蛋白酶體降解[65]。這代表了一種新的機制，PTEN 的這種缺失使得腫瘤細胞能夠避開凋亡，由于IP3R3 的下調使促凋亡的線粒體Ca2+轉移受到損害。

（2）抑癌蛋白BRCA1 相關蛋白1（BAP1）是一種去泛素化酶，其通過穩定IP3R3 來促進ER-線粒體Ca2+的轉移。在長期的環境壓力下，BAP1 的功能會嚴重受損，這與BAP1 基因的獲得性失活突變有關。BAP1 的丟失會導致IP3R3 的下調，從而阻礙受損細胞的有效凋亡清除，并有利于腫瘤的發生和惡性細胞的存活[66]。

此外，癌基因（如Akt/PKB 和FATE1）以及抑癌蛋白（如PML和PTEN）可以通過Ca2+信號調節在癌癥的發展中發揮其他作用[62]，例如凋亡抗性。由于線粒體Ca2+的超載與細胞凋亡死亡相關，因此在MAM 處修飾ER-線粒體Ca2+的轉移會改變細胞凋亡的敏感性[67]。腫瘤細胞可以獲得細胞死亡的抗性，例如，通過過度表達抑制IP3R 介導Ca2+信號傳導的蛋白（如Akt78）或通過增加MAM 處的跨膜距離，使ER-線粒體Ca2+轉移效率降低[68]，從而降低腫瘤細胞的凋亡敏感性。

5 結語

Ca2+通過線粒體上的各種轉運機制穿梭于線粒體、內質網與胞質之間，調節著細胞的各項生理活動。線粒體內的Ca2+濃度會影響線粒體ATP 的合成、線粒體MPTP 的開放、胞質內鈣信號及胞漿鈣穩態的維持。因此，線粒體Ca2+具有重要的生理意義，它的異常與許多重要疾病相關，尤其在一些惡性腫瘤中發揮重要作用。

線粒體通過MCU 等攝取Ca2+進入而通過NCLX 等釋放Ca2+流出，調節著線粒體內與胞質內的Ca2+濃度，維持著Ca2+穩態。細胞內鈣穩態的失衡普遍存在于細胞的死亡過程中，而細胞鈣信號的重組普遍發生在腫瘤細胞的進程中。

線粒體的結構與功能比較復雜，并且處于不斷地分裂融合的動態過程中，還與細胞內各個細胞器之間聯系緊密。因此，線粒體各個方面功能的改變都與腫瘤發生和發展密切相關。然而，目前科研人員對于線粒體內Ca2+的各項機制了解的還不全面，未來很有必要對其進行更深入的研究與探索，以期更好地了解線粒體相關腫瘤的機制，從而提供新的治療思路。