不同正畸力值對哺乳期大鼠正畸牙周組織中HO-1 CC類趨化因子受體1及其配體的影響

焉宏軍 王榮強 張雯姝

正畸即對錯牙合畸形進行糾正，牙合畸形患者可通過正畸達到美容效果[1]。抗缺氧、抗炎蛋白血紅素氧合酶(Heme Oxygenase-1，HO-1)是組織內有效的抗氧化劑。HO-1可能在牙髓血流調控、牙本質形成及牙髓細胞代謝和分化中起調控作用[2-3]。CC趨化因子受體1(CC-chemokine receptor 1，CCR1)及其相關配體表達與正畸牙移動過程及牙周骨改建相關[4]。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)是破骨細胞的特征酶，其表達和分泌與破骨細胞功能密切相關，TRAP陽性細胞的位置和水平與乳牙生理性的根吸收進程密切相關[5]。有研究[6]顯示，哺乳期患者正畸牙移動速率較非哺乳者加快。為提高哺乳期正畸患者的正畸效果，本文制備哺乳期大鼠模型，擬探討不同正畸力值對大鼠牙周組織中HO-1、CC類趨化因子受體1及其配體的影響，以期為臨床哺乳期正畸患者制定最佳正畸治療方案提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇3月齡Wistar大鼠126只(均購自遼寧大連實驗動物公共服務平臺-實驗動物中心)，其中雌性96只，雄性30只，SPF級，平均體質量(200±20)g，分籠飼養，定時給予磨碎的固體飼料，飲消毒清水，每12 h間隔照明，控制室溫18～23°C、濕度在56%、室內噪音60 dB以下，同時定期進行紫外線消毒及通風，適應性飼養一周后開始實驗。整個實驗期間記錄每只大鼠的狀態。

1.2 主要儀器及試劑 0.20 mm結扎絲(杭州晨陽正畸材料廠)，0.012 inch×9 mm鎳鈦螺旋彈簧(北京圣瑪特科技有限公司)，光固化樹脂和樹脂粘結劑(美國MEDENTAL國際齒科機關)，桿式測力計(杭州奧杰醫療器械有限公司)，微型牙科技工打磨機(韓國世新精密株式會社)，雙能X線骨測量密度儀(美國Hologic公司)，高溫高壓真空消毒爐(蘇州順美口腔醫療設備有限公司)，Cobas e601免疫分析儀(德國羅氏診斷公司)，兔抗大鼠HO-1多克隆抗體(美國CST公司，貨號：86806)，FastPrep儀(美國MP醫療器械貿易有限公司)，7500Fast實時熒光定量PCR儀(美國Life technologies公司)。

1.3 方法

1.3.1 哺乳期大鼠模型制備 采用陰道涂片法確定大鼠的動情周期，將大鼠呈臥位固定后用20 μL生理鹽水對陰道進行灌注，在反復吹打3～4次后滴至載玻片上，在40倍鏡下觀察，從而確定大鼠的動情周期。在大鼠動情前期，按照雌雄1∶1的比例合籠，清晨制備涂片鏡下檢查發現孕栓后，即確定雌鼠為妊娠狀態。之后進行單籠飼養，大鼠自然分娩后通過母乳喂養仔鼠，喂養4周后斷奶，此時認定哺乳期模型鼠制備成功。共成功制備72只哺乳期模型大鼠。

1.3.2 不同正畸力值干預 將此72只大鼠按隨機數字表法分為0N組、0.29N組、0.49N組和0.98N組，每組18只。根據分組依次給予0 N、0.29 N、0.49 N及0.98 N正畸力。具體操作：分別對各組大鼠進行全身麻醉，麻醉劑為3.3 mL/kg的水合氯醛，之后用開口器將大鼠口腔撐開，采用尖頭的金剛砂車針在右上第一磨牙近牙頸部頰舌面進行打磨，直至磨出0.5 mm槽溝，再穿一根結扎絲經過第一、二磨牙臨近點的下降，結扎、固定第一磨牙，一端連接鎳鈦螺旋彈簧，在大鼠的切牙亞冠頰舌面、遠中面磨出一0.5 mm槽溝，之后將結扎絲嵌入溝內，連接2個中切牙為一個整體，連接螺旋彈簧的另一端，之后清潔、隔濕中切牙，牙面涂抹上釉質酸蝕劑，之后停留30 s再沖洗吹干，再涂抹樹脂粘結劑，光固化樹脂封閉、固定切牙牙頸部，以防結扎絲松動、脫落，增強支抗。采用測力計測量NiTi彈簧拉伸的力量，確保各組大鼠符合所設定的正畸力值。每日檢查一次加力裝置是否完整，如有脫落、損壞情況，及時修理、安裝。

1.4 觀察指標 比較給予不同正畸力值的4組大鼠在干預前1天及干預第1、3、7天后的CCR1及其配體(CCL3、CCL5)mRNA相對表達量，HO-1水平及TRAP破骨細胞染色水平。

1.4.1 CCR1及CCL3、CCL5 mRNA檢測 每個組選取6只大鼠麻醉后用Rnase-free溶液對心臟進行灌注，之后將第一磨牙拔除，取下牙周膜及牙槽骨，將其置入1.5 mL Rnase-free離心管中，再加入1 mL Trizol試劑，分別用FastPrep儀將組織磨碎、勻漿后用Fastprep程序對總RNA進行提取。采用7500 Fast實時熒光定量PCR儀行逆轉錄，合成cDNA，由上海立菲生物技術有限公司合成引物，之后每個基因做3個復管，對目的基因及β-actin用SYBR綠色熒光定量系統性實時熒光定量PCT擴增，條件為95°C下2 min，之后以95°C下10 s、60°C下30 s、70°C下30 s各行40個循環。計算各指標相對表達量。

1.4.2 牙周組織中HO-1水平的檢測 在每組剩余的12只大鼠中選取6只，采用SP法檢測HO-1水平：牙周組織處理方法同上，兔抗大鼠多克隆HO-1抗體稀釋濃度為1∶100，生物素山羊抗兔IgG(美國CST公司，貨號：7054)作為二抗(稀釋度1∶100)，之后行組織切片，常規脫蠟入水后用微波加熱法對抗原進行修復，DAB進行顯色，蘇木素復染，之后進行封片，陰性對照用磷酸緩沖鹽代替一抗，其他條件相同，陽性表達為細胞胞漿呈棕黃色顆粒狀改變。每張取5個400×高倍視野，表達強度呈色用平均吸光度(optical density，OD)表示。

1.4.3 TRAP破骨細胞染色 將各組剩余的6只大鼠，靜脈采血，離心取血清，使用人骨純化的破骨細胞兔抗大鼠TRAP/CD40單克隆抗體(美國CST公司，貨號：15094)，通過抗酒石酸酸性磷酸酶檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0332)測定TRAP表達，具體步驟按照說明書進行操作。取大鼠第一磨牙壓力側牙牙周膜的近牙骨質側牙周組織，在光鏡下觀察壓力側牙周組織的形態學變化，，并在400倍物鏡下通過OBI200高清晰度彩色病理分析系定量分析TRAP陽性破骨細胞陽性面積。

2 結果

2.1 不同時間點4組大鼠CCR1 mRNA表達量比較 不同時間點4組大鼠CCR1 mRNA表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)。干預前1天，各組CCR1mRNA表達量差異無統計學意義(P>0.05)；干預第1、3天，0.29N組、0.49N組及0.98N組CCR1 mRNA表達量較0N組均增加(P<0.05)，0.49N組及0.98N組CCR1 mRNA表達量較0.29N組均增加(P<0.05)，但0.49N組和0.98N組CCR1 mRNA表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；干預第7天，0.29N組、0.49N組及0.98N組CCR1 mRNA表達量較0N組均增加(P<0.05)，但該3組之間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 不同時間點4組大鼠CCR3 mRNA表達量比較 不同時間點4組大鼠CCR3 mRNA表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)。干預前1天，各組CCR3 mRNA表達量差異無統計學意義(P>0.05)；干預第1、3天，0.29N組、0.49N組及0.98N組CCR3 mRNA表達量較0N組均增加(P<0.05)；0.49N組和0.98N組的CCR3 mRNA表達量較0.29N組均增加(P<0.05)，但0.49N組及0.98N組該指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)；干預第7天，0.29N組、0.49N組及0.98N組CCR3 mRNA表達量較0N組均增加(P<0.05)，與0.29N組比較，0.98N組CCR3 mRNA表達量增加(P<0.05)，而0.49N組和0.98N組CCR3 mRNA表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同時間點4組大鼠CCR3mRNA表達量比較

2.3 不同時間點4組大鼠CCL5 mRNA表達量比較 不同時間點4組大鼠CCL5 mRNA表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)。干預前1天，各組CCL5 mRNA表達量差異無統計學意義(P>0.05)；干預第1～7 天，0.29N組、0.49N組及0.98N組CCL5 mRNA表達量較0N組均增加(P<0.05)；0.49N組和0.98N組CCL5 mRNA表達量較0.29N組均增加，而0.49N組和0.98N組該指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同時間點4組大鼠CCL5mRNA表達量比較

2.4 不同時間點4組大鼠牙周組織中HO-1的OD值比較 不同時間點4組大鼠牙周組織中HO-1的OD值比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。干預前1天，4組大鼠牙周組織中HO-1 的OD值差異無統計學意義(P>0.05)；干預第1天，0.29N組、0.49N組及0.98N組HO-1 的OD值較0N組均增加(P<0.05)，0.49N組和0.98N組HO-1的OD值較0.29N組均增加(P<0.05)，而0.49N組和0.98N組此指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同時間點4組大鼠牙周組織中HO-1 的OD值比較

2.5 不同時間點4組大鼠破骨細胞染色陽性面積比較 不同時間點4組大鼠破骨細胞染色陽性面積比較，差異有統計學意義(P<0.05)。干預前1天，4組破骨細胞染色陽性面積差異均無統計學意義(P>0.05)；干預第1、3天，0.29N組、0.49N組及0.98N組破骨細胞染色陽性面積較0N組均增加(P<0.05)，0.49N組、0.98N組破骨細胞染色陽性面積較0.29N組均增加(P<0.05)，而0.49N組和0.98N組此指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 不同時間點4組大鼠破骨細胞染色陽性面積比較

3 討論

正畸是給予牙齒一定時間、一定強度的機械外力，從而使得牙齒發生移動，其中包括牙周組織、包繞牙根的牙槽骨發生改建，從而使牙齒可以移動到新位置[7-8]。機械外力作用下正畸牙移動的生物學基礎是牙周組織改建，而與該過程密切相關的細胞為破骨細胞及成骨細胞，因此在牙根、牙周組織、牙髓無可逆性損傷情況下采用合適的力值促使正畸牙齒移動是正畸治療的重點[9-10]。另外，患者身體狀況、年齡、加力時間、加力大小、頻率及牙槽骨密度等均會對正畸牙齒移動速度產生影響[11]。有報道[12]顯示，哺乳期患者正畸牙移動速率較非哺乳者快。本文制備哺乳期大鼠模型，擬探討不同正畸力值對哺乳期大鼠正畸牙周組織中HO-1、CC類趨化因子受體1及其配體的影響，以期為哺乳期正畸患者治療方案的選擇，提高正畸效果提供實驗依據。

臨床正畸牙齒移動的最佳力值為0.98 N，而大鼠磨牙是人磨牙的1/50，因此0.19N左右是較為合適的正畸力值[13]；有研究[14]發現，在0.39～0.59N初始力下可以觀察到大鼠牙齒移動，因此本研究選擇0N、0.29N、0.49N及0.98N的正畸力值。本組資料顯示，干預后第1、3天，0.29N組、0.49N組及0.98N組CCR1、CCR3和CCL5 mRNA表達量及破骨細胞染色陽性面積較0N組均明顯增加(P<0.05)，0.49N組及0.98N組CCR1、CCR3和CCL5 mRNA表達量、破骨細胞染色陽性面積均較0.29N組明顯增加(P<0.05)。以上結果表明，隨著正畸力值的增加，哺乳期大鼠的HO-1、CC類趨化因子受體1及其配體、TRAP破骨細胞染色陽性面積均發生顯著變化，其中0.49N及0.98N時以上指標變化幅度較大，即干預效果最顯著，分析原因：CCR1控制前體成骨與破骨細胞的分裂、分化、活化，其在成骨細胞、原始骨髓細胞、RANKL介導的破骨細胞、成骨細胞及破骨前體細胞中均有表達[15-16]。相關研究[2,17]證實，正畸力和患者機體內環境共同影響牙周組織的改建過程，如哺乳期患者正畸牙移動速率較未哺乳組加快，其原因可能與哺乳期患者牙槽骨密度降低有關。因此推測，CCR1可通過調控牙周組織成骨與破骨細胞分化從而參與牙周骨組織改建過程，與前人研究[4]結論相似。另外，干預后不同時間點，0.49N組及0.98N組CCR1、CCR3和CCL5 mRNA表達量及破骨細胞染色陽性面積比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。即0.49N組和0.98N組正畸力值不同時間點干預效果變化相對不明顯。提示0.49N和0.98N正畸力值具有同樣的正畸效果。由此可想，對哺乳期大鼠干預的正畸力值并非越大越好，0.49N可能是本研究大鼠的最適正畸力。

綜上所述，正畸干預可通過促進哺乳期大鼠牙周組織中HO-1、CC類趨化因子受體1及其配體的表達發揮作用，但0.49N是否是哺乳期大鼠進行干預的最佳正畸力值有待后續研究進一步證實。