基因治療脊髓損傷的研究進展

胡金金，李松軍，齊新文

(遵義醫科大學第五附屬醫院骨外科，廣東 珠海)

0 引言

發生脊髓損傷后，神經生長因子和抑制因子之間的平衡失調，影響損傷神經再生和結構可塑性，而這種平衡失調主要由內在因素和外在因素共同作用于神經元及其軸突引起。其中，脊髓損仿局部的神經營養因子缺乏[2]，腦信號蛋白、神經導向因子及其他因子增加[3-4]，膠質瘢痕形成[5]，炎癥反應[6]，細胞外基質中的抑制分子硫酸軟骨蛋白多糖，髓磷脂相關的抑制劑MAG，OMGP和NOG0的增加[7,8]等嚴重影響了脊髓損傷后神經元的再生潛能。在脊髓損傷的恢復中，再生的軸突跨越脊髓病變部位橋接損傷頭尾兩端，并與對應的神經元重新建立神經突觸連接和形成髓鞘，形成神經通路。但是脊髓損傷后多種抑制性因子的作用和受損神經元自身的再生能力有限，因此，可能在治療中需要克服這些內在和外在因素，從而促進神經軸突再生和功能恢復。近年大量的有關基因治療的方法通過改變目的基因的表達，改變局部抑制性微環境，促進神經軸突的再生，因此，基因治療是一個在脊髓損傷治療中很有發展潛力的方法，在這種治療方式中怎么樣選擇合適的轉染方法對提高轉染效率至關重要，轉染效率的提高對于基因治療脊髓損傷具有極大的作用。

1 基因到載體中的轉染方法

基因轉染的方法很多，有生物方法及物理方法，物理化學方法中常用的有磷酸鈣法、基因槍、電穿孔、陽離子脂質體介導的轉染、殼聚糖為載體的轉染，其中陽離子脂質體是最常用的核酸轉染方法，能在體內和體外介導高水平的轉基因表達，具有外源基因整合概率低、細胞毒性低、低免疫反應、無基因插入片段大小限制以及制工藝簡單、使用方便、易于保存等優點[9]。生物方法則主要是以病毒作為載體, 通過病毒感染的方式將目的基因導入到細胞中,病毒載體轉染效率高、基因穩定、便于濃縮及儲存。其中以慢病毒及腺病毒轉染系統最為常用。下面我們著重介紹較為常用的電穿孔法介導質粒載體、脂質體介導的轉染、腺病毒載體和慢病毒載體轉染。

1.1 電孔法介導質粒轉染和陽離子脂質體介導的轉染

其中電穿孔法就是利用在高壓脈沖電場作用細胞膜出現可逆性穿孔這一生物物理現象，將目的基因導入細胞或靶組織中的一個轉染方法，也稱電脈沖轉染[10]。是將分離好的組織細胞置于電轉緩沖液和質粒混合液中，將電極放在容器內壁接觸混合液兩端（電極距離2mm），實施電擊。一般采用不同條件電壓、持續時間及脈沖次數，嘗試電穿孔法介導質粒轉染組織細胞，電擊后立即將上皮小心地轉移至預涂有多聚賴氨酸的玻片上，在DEME培養基中（含10%胎牛血清）中培養，48小時后檢測GFP熒光。而陽離子脂質體介導轉染則是在6孔板內接種細胞HepG2，在37 ℃恒溫條件下的二氧化碳培養箱中培養24 h，保證HepG2貼壁密度在80%～85%，然后使用lipofectamine 2000對研究質粒 PEGFP-C1進行轉染，使其進入HepG2中，后在37 ℃恒溫條件下的二氧化碳培養箱中留置48h后檢測GFP熒光。

1.1.1 電穿孔法介導質粒轉染

這樣的方式適用于體內及體外的轉染，能夠提高其轉染效率，但電穿孔的參數包括電阻、電壓和電容以及電穿孔時間都是影響電穿孔轉染效率的重要因素，高電場強度長時間電擊可增加DNA的導入，但也不可避免地造成細胞或細菌的大量死亡。一般電擊法后當細胞死亡率＜70%，轉染效率呈上升趨勢，當＞70%時轉染效率即呈下降趨勢[11]。

1.1.2 陽離子脂質體介導的轉染

陽離子脂質體是最常用的核酸轉染方法，能在體內和體外介導高水平的轉基因表達，具有方便、經濟、效率高和細胞需要量少等優點[12,13]。脂質體表面所帶的正電荷，與熒光標記的miRNA形成復合物后整體仍帶正電，細胞膜表面主要帶負電荷，因此帶正電的脂質體-miRNA復合物能通過靜電力結合到細胞膜，然后細胞通過內吞作用進入細胞質，這是脂質體轉染的主要機制[14]。脂質體的轉染效率受多種因素影響，如轉染試劑與核酸的比例、細胞密度、轉染后換液的時間以及表達時間等[15,16]。此外，細胞的生長狀態也是決定轉染效率的重要因素之一。

1.2 腺病毒和慢病毒介導轉染組織細胞

是將組織細胞貼壁培養過夜后，分別加入不同滴度的腺病毐和慢病毒并設一組未與轉染病毒的細胞為陰性對照，總共7組，毎組相同量的組織細胞，腺病毒病毒轉染6小時或慢病毒轉染24小時后更換培養基，繼續培養48小時后更換培養基并在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率。通過大量實驗研究發現，與電穿孔法和腺病毒載體相比，慢病毒載體在神經干細胞轉染方面能更有效地將目的基因導入細胞內，是轉染的理想載體[17]。

1.2.1 腺病毒介導轉染組織細胞優勢

①腺病毒外源基因表達水平較高，病毒滴度高，方便于制備和純化；②能同時表達多個基因[18]，它能同時在同一細胞株或組織中用來設計表達多個基因的表達系統；③安全性能高。人類是腺病毒的天然宿主，而且腺病毒感染細胞時其DNA不整合到宿主染色體中，致癌危險小；④與人類基因同源，腺病毒載體系統一般應用人類病毒作為載體，以人類細胞作為宿主，因此為人類蛋白進行準確的翻譯后加工和適當的折疊提供了一個理想的環境。大多數人類蛋白都可達到高水平表達并且具有完全的功能；⑤外源基因容量大，通常復制缺陷型腺病毒可容納約8.7kb的外源基因，而且第三代腺病毒載體承載的外源基因片段甚至可達到37kb[19]；⑥感染范圍廣，能將目的基因轉移到分裂或靜息的細胞中。

1.2.2 慢病毒介導轉染組織細胞優勢

能感染靜止細胞，且不產生嵌合體。作為基因轉導的載體工具，得到了越來越多的認及應用，除能感染分裂細胞外，還能感染不分裂的細胞；它能高效地介導外源目的基因在宿主體內穩定表達，遺傳給后代；其操作簡單、表達廣泛、轉染的細胞類型較多[20,21]；還克服了逆轉錄病毒表達沉默的不足。因此，該方法在轉基因方面得到了廣泛的應用。

2 如何提高轉染效率

在基因治療脊髓損傷中獲得較高轉染效率的病毒對于實驗研究至關重要，不僅能夠增加目的基因的表達引起脊髓損傷局部組織相應物質濃度增高促進損傷脊髓修復，而且能抑制相關負向因子的表達，從而達到雙重修復損傷脊髓的目的，那么如何來提高病毒的轉染效率呢？目前通常的做法有：（1）選擇適合的轉染病毒；（2）正確濃縮病毒的方式；（3）選擇合適的病毒轉染方法及轉染試劑；（4）提高細胞敏感性及細胞同步化等。

2.1 選擇合適的轉染病毒

常用的病毒載體有慢病毒、腺病毒、反轉錄病毒。其中慢病毒載體具有可同時感染分裂和非分裂細胞[22]、外源基因容量大、低免疫原性、目的基因表達穩定等優點，成為目前轉染效率較高、應用較廣的病毒載體[23]。然后選擇合適的病毒載體，是進行基因治療研究的第一步，也是進行后續病毒轉染及基因表達檢測的前提。慢病毒尤其適用于感染較難轉染的細胞如原代細胞、干細胞、甚至神經細胞，能夠將大段DNA整合入細胞核。因此在神經細胞轉染中較常選用的病毒為慢病毒。

2.2 正確濃縮病毒的方式

通過濃縮病毒上清液獲得高滴度的反轉錄病毒，目前濃縮病毒的方式有以下三種方式；分別是超濾管法、超速離心法及病毒濃縮液法。進過基礎實驗研究發現，不同方法濃縮病毒后的綠色熒光蛋白（green fliorescent protein）轉染效率不同，三種濃縮方法中超濾管法濃縮慢病毒后GFP轉染效率最高[24]。

2.3 選擇合適的轉染方法及轉染試劑

常用的病毒轉染方法有貼壁法及懸浮轉染法[25]。貼壁法細胞轉染時，細胞貼于培養瓶壁上，表面積小，且只有表面一層可以接觸到病毒顆粒，因此接觸的表面積有限；而懸浮生長的細胞處于球形，表面積最大，接觸病毒的機率更大，因此轉染的效率也更高。較常用的轉染試劑有：lipofectamine 2000，羅氏試劑（X-treme GENE siRNA Transfection Reagent）及 嘌 呤 霉 素，lipofectamine 2000介導的基因轉導方法雖然簡便易行，但是并非適合所有的細胞種類。而羅氏試劑是近年來新興的一種轉染試劑，具有更為簡便操作手法，更低的細胞毒性，更高的轉染效率，能夠很好的保持細胞的原有形態，在細胞毒性方面展示了優勢，但是轉染效率一般，對于難轉染的細胞，尤其是原代細胞的轉染效果并不理想。然而對于難轉染的原代細胞，嘌呤霉素聯合慢病毒轉染方法則可以達到理想的轉染效率和較小的細胞毒性，且條件可控性與穩定性方面更加優越[26,27]。

2.4 提高細胞敏感性及細胞同步化

在細胞培養液中加入聚凝胺，能夠明顯提高細胞對反轉錄病毒的敏感性。而細胞的同步化則是當細胞進入指數增生期時，將培養細胞放置入4℃冰箱中2～10h（細胞分裂受阻能持續16～20h）；再放回37℃培養箱繼續培養6～12h；在4h內有80%的細胞可進入分裂期，從培養箱中拿出培養瓶，用吸管吸除培養液，排除死細胞和未貼壁的細胞，然后再加入新培養液，手平持培養瓶橫向反復搖動，使培養液不斷沖刷細胞，把分裂中變圓的細胞從瓶沖刷下來；倒出培養液，分裝入另一瓶培養，多數分裂細胞會進入同步化生長。將細胞同步化后，針對分裂期的細胞進行轉染能夠獲得了比常規轉染法較好的轉染效率[28]。

3 小結

脊髓損傷是一種后果嚴重但缺乏有效治療手段的疾病，基因的研究給這一頑癥帶來了希望的曙光，基因治療神經變性疾病目前已經從臨床前研究發展到I和II期臨床研究中的。基因治療脊髓損傷則要求目的基因在損傷局部短時間表達即可。為了克服損傷局部影響神經再生的障礙、促進功能的恢復，需要聯合多種治療法如為軸突生長提供適合的基質，為軸突延伸提供相應的因子，調控神經細胞內部信號級聯反應促進損傷神經元的再生。基因轉染后提供的因子能刺激軸突向病變部位內生長，甚至通過病變部位，而且能激一活神經元自身的軸突再生能力。基因治療是神經損傷綜合治療方法中不可分割的一部分，同時也為脊髓損傷治療提供一種新思路，但是依然有許多工作需要我們去做。