中藥對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面細(xì)菌生物膜作用研究進(jìn)展

矯浩然

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津）

0 引言

隨著環(huán)境與醫(yī)療水平的不斷變化，當(dāng)今社會(huì)的疾病譜較之以往也發(fā)生巨大的改變。發(fā)生于體表的慢性難愈合創(chuàng)面也稱作“潰瘍”，是臨床常見的外科疾患之一，既往針對(duì)此類疾病的回顧性流行病學(xué)研究顯示其發(fā)病率達(dá)到總住院人數(shù)的1.7%[1]。目前對(duì)此類疾病的發(fā)病機(jī)制尚無明確定論，而近年來大量研究表明細(xì)菌生物膜（bacterial biofilm,BBF）可導(dǎo)致創(chuàng)面的愈合延遲[2-4]，因此對(duì)于慢性難愈合創(chuàng)面疾病過程中BBF的作用機(jī)制開始逐步引起了廣大醫(yī)療及科研工作者的重視。中醫(yī)藥對(duì)于慢性難愈性創(chuàng)面的治療具有多方面獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，故本文就近年慢性難愈合創(chuàng)面中細(xì)菌生物膜的特征，及中醫(yī)藥治療對(duì)策等進(jìn)行綜述。

1 慢性難愈性創(chuàng)面細(xì)菌生物膜

1.1 創(chuàng)面病原種類

大量臨床研究顯示在慢性難愈性創(chuàng)面形成生物膜的病原菌種類多樣，主要分布情況革蘭陽性球菌為主，且以金黃色葡萄球菌較多見，少見真菌感染，但不同報(bào)道結(jié)果也提示地區(qū)及年齡差異似乎也可對(duì)病原菌種類有一定影響。

既往姜玉峰[5]等采用多中心橫斷性病例回顧方法，對(duì)我國(guó)17家醫(yī)院中因體表慢性難愈合創(chuàng)面住院治療2513例患者有關(guān)細(xì)菌病原學(xué)特征進(jìn)行分析。結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌是最常見致病菌，其次為銅綠假單抱菌、大腸埃希菌、凝固酶陰性葡萄球菌。革蘭陽性桿菌、革蘭陰性球菌少見。白色念珠菌為最常見真菌。此后亦有不少對(duì)于慢性創(chuàng)面的病原學(xué)鑒定及分析結(jié)果與此實(shí)驗(yàn)相一致。

張凱等[6]回顧分析86例患者的174份創(chuàng)面標(biāo)本行病原菌培養(yǎng)結(jié)果，其中病原學(xué)檢測(cè)陽性率為81.03%，而陽性標(biāo)本中，單純細(xì)菌感染占89.36%，單純真菌感染占5.56%，合并細(xì)菌、真菌感染者占5.68%；檢出細(xì)菌種類主要為大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌；檢出真菌主要為白色假絲酵母菌。李峰等[7]對(duì)70例慢性難愈性創(chuàng)面患者創(chuàng)面分泌物中分離培養(yǎng)的病原菌進(jìn)行鑒定及抗菌藥物耐藥試驗(yàn)。細(xì)菌種類及比重次序結(jié)果與張氏研究一致；藥敏實(shí)驗(yàn)顯示革蘭陰性菌耐藥較嚴(yán)重；革蘭陽性菌的耐藥性較低，其中金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林的耐藥率為35.3%。郝擎宇等[8]回顧性分析139例慢性創(chuàng)面感染患者的創(chuàng)面分泌物的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果及藥敏試驗(yàn)結(jié)果，培養(yǎng)出細(xì)菌菌株共計(jì)251株，其中革蘭陽性菌構(gòu)成比為53.39%，金黃色葡萄球菌檢出率最高。革蘭陰性菌構(gòu)成比45.82%，大腸埃希菌檢出率最高。真菌菌株2例，均為近平滑假絲酵母。且檢出率較高的細(xì)菌菌種對(duì)大多數(shù)抗生素均耐藥。上述研究均提示革蘭陽性球菌為慢性難愈性創(chuàng)面主要病原菌類型，真菌感染較為少見。

然而倪俊等[9]對(duì)60例老年慢性難愈性創(chuàng)面患者的175份創(chuàng)面分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原菌鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示上述標(biāo)本中以革蘭陰性菌為主（占比78.79%），革蘭陽性菌占21.21%。病原菌數(shù)量由多到少依次為銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和鮑曼不動(dòng)桿菌，且對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸等多種藥物高度耐藥。

任少強(qiáng)等[10]研究結(jié)果與倪氏相近，其通過對(duì)177例慢性難愈性創(chuàng)面患者病例資料進(jìn)行回顧性分析，創(chuàng)面標(biāo)本中共分離出174株病原菌，其中以革蘭陰性菌為主，共128株占73.56%，革蘭陽性菌41株占23.56%，真菌5株占2.87%；多藥耐藥菌株占21.84%；且以革蘭陰性菌的耐藥率較高，其中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌均對(duì)多種藥物呈高度耐藥性；而革蘭陽性菌中以金黃色葡萄球菌對(duì)多種抗生素耐藥。

晁生武等[11]分析高原地區(qū)92例慢性難愈性創(chuàng)面患者的創(chuàng)面病原菌，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)加藥物敏感性試驗(yàn)，共分離致病菌92株，其中革蘭陽性球菌占比63.04%，革蘭陰性桿菌為36.96%。革蘭陽性球菌以金黃色葡萄球菌、屎腸球菌和糞腸球菌為主，對(duì)萬古霉素、利奈唑胺等敏感率較高；在革蘭陰性桿菌中以大腸桿菌、肺炎克雷桿菌為主，對(duì)亞胺培南、氨曲南、阿米卡星敏感率較高。

綜上所述，近年來慢性難愈性潰瘍患者創(chuàng)面感染主要細(xì)菌種類集中于金黃色葡萄球菌、銅綠假單抱菌、大腸埃希菌等，且耐藥性均較高。但不同地區(qū)及不同年齡段的難愈性潰瘍患者感染病原菌存在一定差異，進(jìn)一步推論有待于更多的研究支持。

1.2 細(xì)菌生物膜增強(qiáng)抗藥性的相關(guān)機(jī)制

諸多研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌生物膜的形成是成細(xì)菌耐藥性急劇升高的重要環(huán)節(jié)之一[12-14]，這種現(xiàn)象主要取決于下列幾種機(jī)制：

(1)生物膜中的胞外聚合物（extra-cellular polymeric substances, EPS）為細(xì)菌提供了一道天然屏障，能夠隔絕一部分藥物進(jìn)入生物膜[15]。

(2)生物膜自外表面向內(nèi)層的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和含氧量等逐步遞減，營(yíng)養(yǎng)缺乏使深層的細(xì)菌代謝速率減慢甚至進(jìn)入休眠狀態(tài)，從而對(duì)繁殖期抗菌藥物的抗性增強(qiáng)。有研究表明這種營(yíng)養(yǎng)缺乏的應(yīng)急狀態(tài)可以通過協(xié)調(diào)促進(jìn)LapA蛋白水解和預(yù)防源頭LapA合成和分泌來刺激營(yíng)養(yǎng)限制下的生物膜擴(kuò)散，從而降低抗菌藥物療效[16]。

(3)生物膜狀態(tài)下能夠誘導(dǎo)細(xì)菌表型發(fā)生變化，提高對(duì)抗生素的抵抗。氨芐西林誘導(dǎo)大腸埃希菌sRNA SdsR的表達(dá)，通過抑制細(xì)菌的錯(cuò)配修復(fù)導(dǎo)致其耐藥[17]。鮑曼不動(dòng)桿菌可能通過提高pgaB轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而促進(jìn)BBF形成及其厚度增加，且BBF內(nèi)存在的群體效應(yīng)（Qu-orum sensing，QS）又可提高pgaB的轉(zhuǎn)錄，以此形成反復(fù)疊加的惡性循環(huán)[18]。

(4)細(xì)菌種間作用。多種菌混合感染是臨床常見的感染模式之一，而相較于單一菌感染，混合感染的程度更重且預(yù)后更差[19]。Pastar等[20]研究發(fā)現(xiàn)，相較于單純銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）感染，耐甲氧西林金黃色葡萄 球 菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）和PA的復(fù)合感染狀態(tài)下形成混種生物膜可通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子1（Keratinocyte growth factor，KGF-1）而顯著延緩了角化細(xì)胞的生長(zhǎng)，且在銅綠假單胞菌存在的情況下可誘導(dǎo)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌表達(dá)殺白細(xì)胞素（Panton-Valentine leukocidin，PVL）以及α溶血素，加重其毒力作用。

2 中醫(yī)藥對(duì)細(xì)菌生物膜的作用

我國(guó)具有極為豐富的中藥資源，且中藥在防治細(xì)菌生物膜方面具備有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，無論是中藥提取物還是復(fù)方制劑均能夠針對(duì)各種細(xì)菌生物膜起到明顯的治療作用。

2.1 中藥成分提取物的作用

趙赫等[21]運(yùn)用腹膜透析外接短管為載體構(gòu)建外膜蛋白A（OmpA）過表達(dá)的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌（ATCC2592）生物膜模型，探討苦參堿對(duì)ATCC2592形成生物膜能力的影響，結(jié)果表明苦參堿可以上調(diào)中晚期的MicA與σE的表達(dá)，同時(shí)降低OmpA在蛋白質(zhì)和mRNA水平的表達(dá)，以此推斷苦參堿可能是通過調(diào)節(jié)σE-MicA-OmpA通路的作用抑制BBF的形成。

賈子忠等[22]研究黃連素對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)黃連素濃度為4MIC(327681 μg/mL)，掃描電鏡觀察培養(yǎng)液中細(xì)菌BF及活菌數(shù)明顯減少。

董春雷等[23]觀察人參總皂苷與單體皂苷分別對(duì)大腸桿菌及其BBF的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參總皂苷對(duì)大腸桿菌抑制率高于對(duì)BBF的抑制率，這也提示BBF可增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥能力；人參單體皂苷中Rc對(duì)大腸桿菌抑制率最高，而Rd對(duì)生物膜的抑制率最高。這也提示我們單純的抗菌藥物可能并不能針對(duì)細(xì)菌生物膜起到滿意的治療效果。

黃曉敏等[24]體外復(fù)制銅綠假單胞菌生物膜模型并觀察五倍子醇提液對(duì)BBF的作用，結(jié)果顯示五倍子醇提液對(duì)銅綠假單胞桿菌BBF有抑制作用，且這種抑制作用存在明顯的量效關(guān)系--在2倍的MIC(62.5mg/mL)時(shí)對(duì)細(xì)菌生物膜的清除作用最強(qiáng)。

上述研究提示，不僅是清熱解毒類藥物存在抗BBF能力，部分收斂固澀藥乃至補(bǔ)益類藥物也具備對(duì)BBF的抑制作用，這為研究中藥抗BBF作用提供了新的方向。

2.2 中藥復(fù)方的作用

連花清瘟膠囊是臨床常用的抗感染類中成藥物之一，有研究表明其對(duì)金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌及大腸桿菌等常見細(xì)菌的生物膜均有一定的抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜（Staphylococcus aureau biofilm，S.a BF）的抑制作用最強(qiáng)，這種作用可能是通過降低纖連蛋白結(jié)合蛋白 A（fibronectin binding protein A，F(xiàn)nBPA）基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的[25-27]。劉鈺玲等[28]研究發(fā)現(xiàn)痰熱清注射液可抑制MRSA生物膜的形成并破壞其成熟細(xì)菌生物膜的三維結(jié)構(gòu)，使生物膜的水通道破壞、膜厚度降低、結(jié)構(gòu)變得疏松且膜內(nèi)菌體大小不一。同時(shí)能逆轉(zhuǎn)MRSA的耐藥性，恢復(fù)對(duì)頭孢哌酮舒巴坦鈉、哌拉西林鈉他唑巴坦鈉、萬古霉素等抗生素敏感，對(duì)減少抗生素的用量具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。閻增強(qiáng)等[29]采用阿利新藍(lán)剛果紅染色PA生物膜、PVC薄片為載體，LB肉湯培養(yǎng)法建立體外模型，按照干預(yù)方式不同分為：無藥品組、黃芩組、三黃燒傷靈組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三黃燒傷靈在2MIC，黃芩在時(shí)對(duì)能夠明顯減少膜內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)，提示三黃燒傷靈與中藥黃芩對(duì)成熟的PA生物膜有一定破壞作用。

2.3 中藥抗慢性難愈性創(chuàng)面BBF的作用

單瑋等[30]選用SD大鼠灌胃法制備清熱敗毒合劑含藥血清，并應(yīng)用該血清干預(yù)由臨床慢性難愈性創(chuàng)面住院患者送檢菌株培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌生物膜，檢測(cè)細(xì)菌增殖、BF形成情況以及細(xì)菌自誘導(dǎo)分子AI-2濃度水平。結(jié)果提示清熱敗毒合劑可降低難愈性創(chuàng)面中金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌的AI-2濃度，抑制BF的形成與細(xì)菌增殖，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。徐麗英等[31]觀察陳蘭花顆粒聯(lián)合抗生素治療的糖尿病足慢性創(chuàng)面患者治療前后創(chuàng)面膜性組織中細(xì)菌檢出率、菌落計(jì)數(shù)及血清hs-CRP、IL-6、PCT的水平，并與單純基礎(chǔ)治療組進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果顯示陳蘭花顆粒外用可抑制DF慢性創(chuàng)面生物膜炎癥因子表達(dá)，協(xié)同抗生素起到更好的治療作用。

3 小結(jié)和展望

慢性難愈性創(chuàng)面是目前臨床上的常見疾患，其病變機(jī)制尚未被完全闡明，臨床治療存在一定難度。創(chuàng)面細(xì)菌生物膜的形成作為創(chuàng)面難愈的成因之一也逐步引起臨床與科研領(lǐng)域的重視，中醫(yī)藥作為我國(guó)的特色治療手段具備其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，目前針對(duì)慢性難愈性創(chuàng)面BBF的中藥治療研究尚不充實(shí)，對(duì)其具體作用機(jī)制以及各種中醫(yī)特色治療方法的結(jié)合應(yīng)用或許是今后有望進(jìn)一步提升療效和進(jìn)行研究的方向。