活性氮自由基在口腔中的作用及其機制

馬歆茹，駱春梅，王沙沙，杜 芹

(1.遵義醫科大學，貴州 遵義 563003；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院口腔科，四川 成都 610072；3.川北醫學院，四川 南充 637000；4.電子科技大學醫學院，四川 成都 610054，5.中國科學院成都生物研究所，四川 成都 610041)

活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)分子家族的成員以一氧化氮為中心，包括過氧亞硝基陰離子(ONOO-)、亞硝酸根離子(NO2-)、硝酰基陰離子(NO-)、二氧化氮(NO2)和三氧化二氮(N2O3)等[1]。RNS可以介導口腔中多種病理生理反應。在生理情況下，RNS對維持口腔功能十分重要，如牙周組織中的NO可以擴張牙周組織內血管，增加局部血流，促進傷口愈合及改善皮瓣存活[2]。而在病理狀態下，由感染等因素導致口腔中RNS顯著升高，此時RNS雖可作為宿主非特異性免疫重要的一部分有效抵抗外界感染，但濃度過高的RNS會導致硝化應激，引起宿主細胞損傷或凋亡，介導或參與牙周炎、根尖周炎、扁平苔蘚和口腔癌等疾病。本文主要介紹口腔中RNS的構成及其病理生理功能，探討RNS對口腔健康的雙重作用，為口腔疾病防治提供理論基礎。

1 口腔內主要RNS的來源及作用機制

1.1 NONO廣泛存在于體內各組織器官中，是一種具有生物活性的氣體信號分子，它作為親脂自由基可以通過擴散穿過細胞膜進入胞質[3]。體內的NO可以通過一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)途徑和硝酸鹽-亞硝酸鹽-NO途徑產生，其中NOS途徑是產生內源性NO的主要途徑。哺乳動物的NOS主要由L-精氨酸的代謝產生，分三種類型，在組織中表達不同并通過適當的刺激選擇性激活，產生NO[4]。其中神經型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)和內皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)在短時內只能產生少量的NO，主要起調節生理功能的作用，如參與平滑肌松弛、調節血管舒張以控制血壓、參與神經元發育和神經信號傳遞、參與組織穩態、參與學習及記憶的過程以及抑制血小板聚集等[5]。但另一種NOS，誘導型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)往往不在健康情況下表達，而在受γ-干擾素和脂多糖等細胞因子或微生物產物誘導后的巨噬細胞中表達。iNOS被轉錄激活后通過催化精氨酸，可在幾小時內產生大量的NO，這種過量的NO往往介導細胞毒性。

無論通過哪一種途徑合成，生物系統中的NO都可以通過兩種不同的信號通路發揮其生物學作用：環鳥苷3，5-單磷酸cGMP依賴性通路以及cGMP非依賴性通路。在前一種通路中，NO與可溶性鳥苷酸環化酶的血紅素基團結合，激活可溶性鳥苷酸環化酶產生cGMP以及活化蛋白激酶G，在神經與血液系統中起信號傳導作用。而后一種通路則是通過對半胱氨酸硫醇的S-亞硝基化以及對蛋白質、脂質和核酸的硝化，介導生物分子的化學修飾，引起細胞損傷。

1.2 ONOO-ONOO-由NO和超氧化物反應而產生，在NO和超氧化物接近等摩爾比時其產量最大，是一種比NO更穩定，且活性更強的氧化劑及硝化劑，是導致硝化應激的主要成分。

生理條件下ONOO-的產量很低，起維持生理功能的作用。與NO介導的生理作用相似，ONOO-可作為信號分子參與信號傳導過程，如調節血管收縮及調節免疫功能。但在炎癥等病理情況下，細胞因子或微生物刺激吞噬細胞，生成過量的的超氧陰離子(O2-)和NO，且二者發生反應生成大量的ONOO-。ONOO-能與蛋白質、脂質和核酸等大多數生物分子反應，促進生物分子氧化或硝化而導致細胞損傷。例如，ONOO-可以硝化蛋白質的酪氨酰基形成硝基酪氨酸，過量的ONOO-可以導致硝基酪氨酸在體內的積累，改變蛋白質結構與活性功能[8]。ONOO-還可以與鳥嘌呤快速反應生成8-硝基鳥嘌呤，8-硝基鳥嘌呤有潛在的致突變作用和致癌的可能性，與腫瘤侵襲和癌癥患者的預后不良顯著相關。ONOO-介導的生物分子的修飾在多種疾病中起了重要的作用，包括高血壓、動脈粥樣硬化、敗血癥、膿毒癥、缺血再灌注損傷和神經退行性疾病等全身疾病，以及牙周炎、口腔腫瘤和輻射誘導的唾液腺功能障礙等口腔疾病[9]。

高濃度的ONOO-對真核生物和原核生物都具有強于NO的細胞毒性。組織中長時間生成適量的ONOO-也會導致細胞的大量氧化和潛在破壞，影響細胞功能及信號傳導，誘導細胞死亡。除了損傷機體正常細胞外，ONOO-還能作為一種重要的抗菌劑發揮強于NO的微生物毒性作用，參與機體免疫。

1.3 NO2-體內的NO2-有三種不同的來源。第一種來源是作為ONOO-等其他RNS在體內分解生成的代謝產物。第二種來源是由硝酸鹽在體內還原成亞硝酸鹽：當人體食用含硝酸鹽的食物后，硝酸鹽經唾液腺濃縮釋放進入口腔，通過口腔內硝酸鹽還原菌的作用將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[6]。第三種來源為膳食攝入的亞硝酸鹽。

NO2-能通過兩種途徑發揮細胞保護作用。在缺氧和炎癥條件下NO2-含量升高，黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase，XOR)發揮NO2-還原酶功能，催化NO2-還原為NO發揮細胞保護作用。除了這種途徑外，在不依賴XOR的條件下，NO2-可以通過與血紅蛋白反應，降低血紅蛋白還原NO的能力而發揮細胞保護作用。但是NO2-也能通過衍生出多種RNS修飾生物分子，引起細胞損傷，或促進N-亞硝胺(N-nitrosamines)的形成導致炎癥和癌癥等病理現象。

1.4 N2O3NO能在有氧環境下與氧分子反應，自動氧化為NO2及N2O3，而N2O3可以解離生成NO+和硝酸鹽。口腔微環境中的NO能通過這種方式轉化為其他RNS。當體內NO的量遠大于O2-時，NO與O2-反應主要生成N2O3。當體內巨噬細胞受γ-干擾素刺激后，可比受未刺激時多合成3～4倍的NO，這時NO與O2-反應主要生成N2O3。N2O3不穩定，它可以促進硫與胺的亞硝化，生成S-亞硝基硫醇(S-nitrosothiols，RSNO)和N-亞硝胺。

2 口腔中RNS的生理作用

口腔中富含多種RNS，它們主要有兩個來源：由NOS產生的NO衍生或源于口腔微環境中硝酸鹽還原菌產生的NO2-。這些RNS不僅起調節和維持口腔生理功能的重要作用，還能在多種口腔硬軟組織疾病中發揮正面作用。

從表3可以看出，合金鋅粉加入量按照貧鎘液鈷的30倍加入，鋅粉消耗量大，除鈷效率不到20%，鎘也并未置換出來，并未有效地解決系統鈷循環、富集的問題。

2.1 抗菌RNS可以被機體的免疫系統用于防御感染，殺滅病原微生物。在機體遭受外界微生物的入侵后，微生物及其產物刺激巨噬細胞轉錄激活iNOS，在短時間內產生大量NO。NO可介導細胞毒性以殺傷微生物，它可以結合螯合鐵池生成二硝基-鐵絡合物(DNICs)抑制細菌功能，還能通過與ROS的反應而增強其細胞毒性。外界微生物入侵后，吞噬細胞活化促進NADPH氧化酶活性，通過呼吸爆發產生大量的O2-。O2-不僅能在酸性條件下快速歧化生成H2O2發揮抗菌作用，還能與與NO反應生成ONOO-發揮更強的抗菌作用。口腔內的RNS能作為機體抵抗病原菌的非特異性防御機制，如iNOS產生的NO可以控制牙齦卟啉單胞菌感染，抑制根尖周細菌從而控制牙槽骨吸收的進展。而缺乏NO會加速牙槽骨的感染性吸收[10]。

在口腔中，硝酸鹽還原菌產生亞硝酸鹽也可以在齲病和牙周炎等口腔疾病中發揮抑菌作用。唾液中高濃度的硝酸鹽有助于齲病的預防，在變異鏈球菌和乳酸桿菌等致齲產酸菌導致的牙齒周圍的酸性環境中，亞硝酸鹽被快速質子化形成亞硝酸，而不穩定的亞硝酸會歧化形成以NO為主的一系列氮氧化物，起抑菌或殺菌作用[11]。另一方面，在食用富含硝酸鹽的食物后，唾液的PH會升高，抑制致齲菌的生長[12]。除預防齲病外，亞硝酸鹽也能在牙周炎和口念珠菌病等口腔炎癥疾病中發揮抗菌作用，炎癥狀態下唾液腺能分泌更高濃度的硝酸鹽，增加唾液的保護潛力。這種高濃度的硝酸鹽可由硝酸鹽還原菌還原為亞硝酸鹽，發揮抑菌作用[13]。

口腔中的亞硝酸鹽可隨唾液進入酸性胃環境中而發揮抗菌作用，在一定程度上防止胃腸道疾病。此外，一些口腔微生物還能通過口腔中亞硝酸鹽在全身感染中發揮積極作用。副鰻鏈球菌及血鏈球菌等口腔共生鏈球菌在有氧條件下能主要通過丙酮酸氧化酶SpxB產生H2O2，H2O2與口腔中的亞硝酸鹽反應形成ONOO-等RNS，抑制銅綠假單胞菌的生長，利于肺部囊性纖維化感染期間肺部功能的改善[14]。

2.2 調節血管舒張口腔中的亞硝酸鹽進入體循環后，能轉化為NO等RNS發揮一些生理作用，體循環中的NO可以通過血管舒張發揮一定的降血壓作用，益于心血管健康。由于口腔內硝酸鹽還原菌是產生亞硝酸鹽的一個重要來源，口腔微生物群的變化會引起NO含量變化，通過調節血管舒張影響血壓。因此，使用抗菌漱口水的人口腔微環境中及血漿中亞硝酸鹽含量減少，使收縮壓和舒張壓增高[15]。

口腔軟組織中NOS產生的NO通過調節口腔血流及唾液的流動，維持著口腔的生理功能。口腔組織的血液循環受nNOS和eNOS合成的NO調節，對于維持口腔健康至關重要。例如，NO調節著牙齦中的血流灌注，使血管舒張并向遠端擴散，尤其是向根尖部血管擴散，對皮瓣存活和傷口愈合起積極作用[2]。適量的NO維持牙周組織的健康，在早期牙周炎中，牙周組織中的NO通過舒張血管平滑肌調節局部血流，起改善微循環的作用。

2.3 控制口腔疾病的發展以NO為代表的RNS可以控制一些口腔疾病的發展。Korde等[16]的研究表明，口腔癌組織中的NO能通過抑制或殺傷腫瘤細胞發揮一定的抗腫瘤作用，并且iNOS的上調可能會抑制口腔癌細胞的轉移和致瘤性。在牙周炎及根尖周炎中，NO控制著牙槽骨吸收的進展，高濃度的外源性NO可誘導破骨細胞祖細胞凋亡，抑制成熟破骨細胞的再吸收活性而抑制牙槽骨的吸收。

3 口腔中RNS的病理作用

口腔內RNS除了發揮正面作用外也能導致多種病理狀態。例如，由微生物感染產生的RNS通過靶向微生物起抗菌作用，但RNS靶向的分子部位不僅是微生物，還包括了宿主，因此RNS也會損傷宿主細胞。這種由RNS引起的生物分子修飾會導致一些病理狀態，與多種口腔疾病的發生發展密切相關。

3.1 促進牙周炎的進展許多研究證實了炎癥牙周組織中iNOS的活性及NO含量高于正常牙周組織，這是因為牙齦卟啉單胞菌、伴放線聚集桿菌和中間普氏菌等牙周致病菌能通過刺激巨噬細胞誘導iNOS表達[5，7，9]，使局部持續產生大量NO和ONOO-，ONOO-與酪氨酸反應生成硝基酪氨酸，導致牙周組織損傷。iNOS的表達及隨后生成的RNS促進了牙周病的進展，造成牙周局部組織的破壞、牙槽骨吸收。如由iNOS產生的NO不僅可以通過增強破骨細胞的分化和活性，還可以和ONOO-通過激活聚ADP-核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]介導下游組織毒性，導致牙槽骨吸收和牙周炎中血漿外滲[17，18]。

一些外源性因素或全身因素促進了牙周炎中RNS的產生。例如，吸煙的牙齦炎患者的牙齦組織內能檢測到較不吸煙的牙齦炎患者更強的iNOS表達，參與牙周病的發病機制[19]。患糖尿病的牙周炎大鼠的牙齦組織中ONOO-及硝基酪氨酸含量增高，提示糖尿病患者能通過硝化應激加重牙周病的程度[20]。

3.2 促進根尖周組織破壞來源于牙髓和根管系統的細菌感染導致根尖周聚集大量的免疫細胞，引起根尖周炎癥。各種急慢性根尖周炎患者的根尖周組織中都存在著大量表達iNOS的細胞，如巨噬細胞、多形核白細胞、淋巴細胞和內皮細胞，使根尖周組織富含NO。與牙周炎中牙槽骨吸收相似，由iNOS產生的NO在炎癥狀態下促進根尖周牙槽骨的吸收，并且NO與O2-反應生成的ONOO-可導致根尖周組織的嚴重破壞。

3.3 促進口腔癌的發生由RNS導致的硝化應激是口腔癌發病的主要原因，RNS的增加導致唾液抗氧化系統的消耗減少，使氧化劑與抗氧化劑失衡，造成生物分子的氧化損傷，特別是NO介導生成的脂質過氧化物——丙二醛、氧化蛋白質和氧化DNA的形成與口腔癌的病理機制密切相關。許多研究表明，口腔癌患者唾液中RNS增加而抗氧化劑含量顯著減少，且類似的氧化劑——抗氧化劑失衡也發生在口腔癌患者癌組織中及血液中，提示口腔癌患者抗氧化防御機制減少而硝化應激增加[21～23]。此外，口腔中硝酸鹽還原菌產生的亞硝酸鹽與胺和酰胺的反應可生成N-亞硝胺，N-亞硝胺具有很高的致癌性和致突變性，也促進了口腔癌的發生[21，22]。

3.4 參與口腔扁平苔蘚的發生發展NO與口腔扁平苔蘚(orallichen planus，OLP)的發生發展有著緊密聯系。一些研究表明，OLP患者的唾液NO和亞硝酸鹽明顯增高，這可能是由于炎癥狀況而導致iNOS的過表達，產生了更多的NO，從而促進細胞凋亡，在OLP的組織病理學中被視為基底細胞變性[24，25]。盡管NO在OLP的發病機制中的具體作用尚不明確，但對唾液NO的測定可能對扁平苔蘚的診斷、監測及治療有一定意義。

3.5 參與Sj?gren綜合征的進展NO的產生也與Sj?gren綜合征密切相關。Benchabane等[26]的研究表明，由于IL-6和IL-17 A等炎性因子的存在，Sj?gren綜合征患者唾液腺組織中的iNOS被激活而產生過量NO，而過量的NO可能導致唾液腺炎性損傷和腺泡細胞萎縮。

3.6 促進唾液腺功能障礙的發生外源性輻射能促進體內RNS和ROS產生，引起一系列疾病。頭頸部惡性腫瘤的患者在接受放射治療后，唾液腺組織中會產生大量的NO與O2-，二者反應生成ONOO-造成生物分子的損傷，使這些患者易患口干癥。輻射后產生的RNS可能是輻射誘導的唾液腺功能障礙的重要致病因素。

4 結語

RNS是近年來學者們研究的熱點，口腔中富含多種RNS，發揮著多種病理生理作用。在正常生理情況下，RNS維持著口腔的正常生理功能，而在一些病理狀態下，由于RNS的含量上升或機體抗氧化系統障礙，導致了硝化應激。RNS與多種口腔疾病的發生發展密切相關，RNS能在口腔疾病中發揮一定的正面作用：RNS可以在口腔感染性疾病中發揮抑菌作用、控制一些口腔疾病的進展以及用于口腔疾病的治療。RNS在口腔疾病的治療方面展現出一定的臨床應用前景：NO可作為治療一些口腔疾病的靶標，抑制NO或使NO過量產生可以作為口腔疾病的治療策略，如使用iNOS選擇性抑制劑可以加速根尖周病的愈合[27]，使用外源性NO能抑制OSCC癌細胞的增值[28]。但過量的RNS也是導致或促進多種口腔疾病的重要因素，因為RNS會導致生物分子的化學修飾并介導損傷，參與多種口腔疾病的病理過程。隨著對口腔中RNS的作用機制的研究進一步深入，逐漸豐富了人們對一些口腔疾病發生發展機制的理解，為口腔疾病的預防和治療提供了新的方向。