NF1突變類型及相關研究進展

劉芷兮，陳 燕，肖洪濤，2△

(1.四川省腫瘤醫院·研究所、四川省癌癥防治中心，臨床藥學部；電子科技大學醫學院，四川 成都 610041；2.個體化藥物治療四川省重點實驗室，四川 成都 610041)

I型神經纖維瘤病 (neurofibromatosis type 1)是常染色體顯性遺傳病，每3000個新生兒中就有1個患兒，其致病基因位于常染色體17q11.2。它是由腫瘤抑制基因NF1突變引起的，NF1基因在17q11.2處有一個大基因座(350 kbp)，它包含61個外顯子，其中含有4個交替拼接的外顯子，轉錄后大小為12 kbp信使RNA(mRNA)，其中包含8454個核苷酸的開放閱讀框[1]。該基因編碼ras信號通路的負調節因子，突變主要影響神經嵴衍生組織類型(如雪旺細胞和黑素細胞)[2]。外顯率為100%，其中的大部分患者，為散發式病例，臨床表現復雜，且涉及多個系統[3]。患有NF1的兒童和成人出現包括良性和惡性腫瘤在內的疾病，包括認知缺陷、癲癇發作、生長異常、周圍神經病變和以咖啡色斑點和輔助雀斑的形式出現的異常色素沉著。神經系統也會出現并發癥，如不受控制的偏頭痛等[4]。

1982年，神經纖維瘤病被分為7類[5]，NF1也稱馮雷克豪森氏病，占神經纖維瘤病的85%以上也是本文主要的研究對象。NF2為聽神經鞘瘤病，與NF2基因失活有關，有顱內腫瘤，一般表現為頭暈，耳鳴，視力下降，癥狀存在時間可數月至數年不等。NF3為混合型神經纖維瘤病，具有NF1與NF2兩種表征。NF4為變異型神經纖維瘤病。NF5為節段型神經纖維瘤病(segmental neurofibromatosis，SNF)。NF6是僅有牛奶咖啡斑型神經纖維瘤病，NF7為遲發型神經纖維瘤病，發病在30歲以后[6]。

闡明NF1基因突變的類型，對于涉及相關疾病的基礎和臨床研究具有重要的意義，本文主要聚焦NF1的突變及相關表型，NF1基因突變無規則無序，總結NF1突變包括以下多種類型：染色體畸變、多個外顯子缺失、大插入、終止突變(無義突變)、氨基酸替代、內含子突變及3’ 端非翻譯區突變等，新發突變高，且無明顯熱點突變。其中體細胞傾向于缺失，而生殖細胞傾向于點突變。

1 突變類型

1.1 錯義突變錯義突變通常是指編碼某一種的氨基酸的密碼子由于錯誤的堿基互補配造成氨基酸的改變，致使蛋白質喪失原有的功能與結構。柳州市婦幼保健院日前，對一例先證者為Ⅰ型神經纖維瘤病的患兒進行基因突變鑒定與家系研究。該患兒女，8歲，生后即有神經纖維瘤典型體征，軀干與四肢牛奶咖啡斑，2歲超聲顯示，左眼眶周腫塊等。使用高通量測序與sanger測序發現該患兒NF1基因c.1013 A>G雜合變異，該變異導致第338號氨基酸由天冬氨酸變為甘氨酸 (Asp變為Gly)，為錯義突變，患兒生物學父母該位點未見異常，分析為散發的錯義突變[3]。

1.2 無義突變無義突變通常是指因為DNA的突變提前出現終止密碼子導致，使多肽鏈合成中斷，形成一段無意義的蛋白。重慶醫科大學17年報道了一例NF1無義突變的病例。患兒女(先證者)，11歲。軀干及四肢見散在牛奶咖啡斑、腋窩雀斑及皮膚神經纖維瘤。患兒家族中有類似疾病史，臨床診斷為Ⅰ型神經纖維瘤病(NF1)。基因測序明確突變位點為NF1基因c.2351 g>A，該突變是第一次在NF1基因中報道。先證者母親幼兒時也有Ⅰ型神經纖維瘤體征，經測序發現患兒母親與患兒攜帶相同突變。國際人類基因突變數據庫(HGMD)還未檢索到該突變[7]。

湖南航天醫院皮膚科報告1例I型神經纖維瘤家系并進行基因突變的檢測。先證者男，5歲，PCR產物經測序發現，先證者NF1基因的第2 620位堿基出現A/T雜合突變(c.2620 A >T)，致874位密碼子由原來編碼賴氨酸(Lys) 的AAG突變為TAG，形成提前終止密碼子，故造成蛋白截斷。而先證者的父親、祖母中也存在相同的突變，在(HGMD)中也尚未見此突變報告[8]。

1.3 基因大片段缺失與剪切突變北京協和醫院在2016年分析了8例Ⅰ神經纖維瘤的病例，8例患兒就有7種突變的形式。其中兩例為NF1基因全部缺失，一例為基因的剪切突變c.3975-2delA(成熟RNA中含有內含子或缺失外顯子序列的一類突變。)一例無義突變c.3721 C>T，p.R 1241 X。另外5名患者分別為四種突變則為c.49744977delCTAT，p.Y1659 TfsX17、c.39873988delAG，p.S1329fsX4、c.1511delC，p.P504QfsX22和c.6388delC，p.L2130fsX3[9]。

1.4 移碼突變(缺失突變)2014年，中國麻風皮膚病雜志刊登了NF1基因突變突變檢測的一篇文章，該兩名患者均有NF1典型體征，出生時軀干和四肢有咖啡牛奶斑，隨著年齡增長不斷擴大，但兩者聽力視力智力均正常。文章就這兩名患者進行sanger測序，其中一位患者測序結果為27號外顯子存在c.3691delA移碼突變(p.R1207DfsX8)[10]。安徽醫科大學陳濱的碩士學位論文中報道了一位NF1基因無義突變的患者(c.3443-3444delCA)，20號外顯子第3443-3444位置的兩個堿基缺失，導致后續終止密碼TGA提前出現，形成截短蛋白[11]。移碼突變是指在DNA片段中丟失或插入一個或幾個堿基，可以不是三的倍數，引起遺傳信息的改變。

2 NF1缺失類型分類

根據Dorschner等的相關研究[12]，總的來說可將NF1的缺失類型分為4大類(第1，2，3和非典型缺失)。1型缺失占所有大型NF1缺失的70～80%[13]，大多數1型NF1缺失是因為卵母細胞在減數分裂過程中，染色體間非等位基因同源重組(NAHR)造成的。NF1基因中的NAHR是由NF1-repa和NF1-repc所介導的低拷貝重復序列引起的。在這些低拷貝重復中，檢測到兩個NAHR熱點內重復的斷點(recurrent breakpoints)，稱為同源重組位點1和2[14]。2型NF1缺失通常是由有絲分裂過程中的NAHR引起的，因此與體細胞位點缺失有關[15]。與1型NF1缺失相比，2型缺失與13個蛋白質編碼基因的半合子性相關。至少10%的大型NF1缺失屬于2型，也許還遠遠不止[16]。3型NF1缺失非常罕見，這些1.0 MB的缺失僅發生在所有NF1總缺失患者中的1%～4%，并且是由NF1-repb和NF1-repc之間的NAHR介導引起的，導致總共9個蛋白質編碼基因的半合子性。非典型的NF1缺失并不表現出重復的斷點，并且就其大小和位于缺失區域內的基因數量是非常不同的。非典型NF1缺失不僅在其長度上是高度異質，而且就其潛在的突變機制而言，可能涉及異常DNA雙鏈斷裂修復或復制以及反轉錄轉座子介導的機制[17]。

3 基因型與表型關系

迄今為止，僅鑒定了NF1中的少數的基因與表型的關系。其中之一是NF1基因第17外顯子中的三堿基對的缺失(c.2970-2972 delAAT)導致單個氨基酸(p.Met992del)的丟失，這種基因的改變與相對輕微的NF1表型相關，其特征是出現咖啡色斑(CALS)和皮褶雀斑，無外部可見的皮膚叢狀神經纖維瘤[18]。另外NF1中與基因-表型相關的是密碼子p.Arg1809的錯義突變，具有該特異性NF1突變的個體表現出CALS(可能有雀斑，可能無)和Lisch結節，但沒有外部可見的叢狀神經纖維瘤或皮膚神經纖維瘤[19]。然而，密碼子p.arg1809的錯義突變似乎非常罕見，因為在7000名已識別突變的NF1患者隊列中，只有1.2%的患者觀察到錯義突變。在同一組患者中，同一種氨基酸缺失(p.Met992del)的發生率為0.8%[20]。

4 NF1高表型變異性原因

為了解釋NF1的高表型變異性，科學家們給出了三類不同因素的作用。第一個因素是發生在NF1胚胎發育中或者更早(如父母體內配子發生)的突變性質。NF1中一個非常小的部分突變都與患者特定的體征有關，所以這表明，突變的性質并不是關鍵的決定因素[21]。第二個因素描述了一些特定已知的神經纖維瘤修飾物的存在，包括但不局限于遺傳因子、性激素和腫瘤微環境[22]。第三個因素發生在細胞生長過程中的某一特定時間，與NF1基因的失活密切相關。NF1疾病患者只在他們身體的一小部分表現出來，最可能的解釋是體細胞嵌合體，第一個NF1突變發生在胚泡和成神經細胞階段之間的胚胎發育后期，這樣一些細胞就可以存活下來，并保持NF1的野生型[23]。

5 NF1基因突變分析

NF1基因的突變率比大多數其他遺傳疾病基因高10倍左右[24]。目前，在人類基因突變數據庫(HGMD)中，已有超過2600種不同的NF1遺傳突變點。被報道為是造成NF1疾病的原因，從跨越數個堿基大基因組的缺失到改變編碼氨基酸或剪接位點功能的單堿基對替換，其突變大小各不相同[25]。雖然NF1突變譜明確定義為錯義/無義(27.7%)，剪接(16.3%)，微缺失(26.9%)，微插入(11.1%)，總缺失(> 20 bp；13.3%)，總插入(> 20 bp；2.0%)，復雜重排(0.6%)等，但沒有證據表明NF1內有任何局部的突變簇[26]。大多數(> 80%)的NF1突變后蛋白失活，基本會導致轉錄物或蛋白質的完全缺失。由于基因大小和結構較大，以及突變范圍跨度大，患者中NF1突變的鑒定仍然很困難[27]。一直以來，使用互補組合方法鑒定了95%患者的基因突變位點，方法包括蛋白質截斷實驗，熒光原位雜交，異源雙鏈DNA，Southern印跡雜交和細胞遺傳學分析等[28]。一般初步的報告是通過測序檢測NF1患者的樣本，然后基于DNA的測序為臨床診斷測試提供結論(見阿拉巴馬大學伯明翰醫學基因組實驗室的網站)。因此，NF1突變分析有助于在臨床中診斷不確定的NF1的病例[29]。

6 討論

NF1基因突變類型及表型的闡明，可為下一步的研究奠定基礎，伴隨著新的基因治療手段和方法的出現，對于由NF1突變導致的疾病，采取基因治療方法治療該類疾病提供支撐和依據。