硫酸鹽還原菌原位修復六價鉻污染土壤

韓建均，柴陸軍，張 娟，梁雪杰

（1. 北京本農科技發展有限公司，北京 100176；2. 中化環境控股有限公司，北京 100166）

我國是一個鉻鹽生產大國，鉻渣對堆場和周圍環境造成嚴重的污染。土壤中的鉻污染物主要來自鉻鹽生產排放的鉻渣［1］。在土壤中Cr（Ⅵ）毒性很大，其毒害程度比Cr（Ⅲ）大100倍［2］，Cr（Ⅵ）含量被列為我國土壤環境質量評價的8個重金屬控制指標之一［3］。

目前，鉻在土壤中主要以Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）兩種價態存在，當pH大于5時，Cr（Ⅲ）會以沉淀形式存在，易于在土壤中穩定下來［4-5］。因此，常采用還原穩定化法將污染土壤中的Cr（Ⅵ）還原為遷移性和毒性較低的Cr（Ⅲ）。目前，鉻污染的治理措施包括物理法、化學法和生物法［6-11］。與傳統的物理、化學修復技術相比，微生物修復法適用于環境敏感地區的原位修復，因其具有操作簡單、修復成本低、不會造成二次污染等優點。研究發現，芽孢桿菌（Bacillussp. ）、不動桿菌（Acinetobacter junnii）、微代謝棒狀桿菌（Corynebacterium paurometabolum）、大腸肝菌（Escherichia coli）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、蒼白桿菌（Ochrobactrumsp. ）、氧化硫硫桿菌（Acidithiobacillus thiooxidans）、脫硫弧菌（Desulfovibriosp. ）等能夠直接還原Cr（Ⅵ）為Cr（Ⅲ）［12-19］。目前，利用微生物修復鉻污染土壤還處在實驗室階段［20］，對于微生物原位修復鉻污染土壤的工程化研究至今未有報道。

為研究微生物原位修復鉻污染土壤的可行性與效率，本工作以浙江某鉻污染土壤為試驗地，以FeSO4化學還原法為對照，開展硫酸鹽還原菌原位修復鉻污染土壤的田間試驗研究，根據土壤中Cr（Ⅵ）的下降率分析微生物原位修復Cr（Ⅵ）污染土壤技術的可行性。

1 試驗部分

1.1 材料和設備

浙江某鉻污染場地堆有大量爐渣，修復深度范圍內土層主要由素填土、粉質黏土、淤泥組成。鉻污染場地土壤的基本理化性質見表1。由表1可見，土壤樣品的Cr（Ⅵ）含量為6.48 mg/kg，已經大于《土壤環境質量 建設用地土壤污染風險管控標準》（GB 36600—2018）［20］中的第一類建設用地的土壤污染風險篩選值（3.00 mg/kg）。

硫酸鹽還原菌：從鉻污染場地土壤中分離獲得，經鑒定為脫硫弧菌（Desulfovibriosp.）。該細菌具有較強還原Cr（Ⅵ）的能力，其最適還原條件為30 ℃，pH 7。

種子液培養基：NH4Cl 1.0 g、MgSO4·7H2O 2.0 g、Na2SO41.0 g、酵母膏1.0 g、CaCl20.1 g、K2HPO40.5 g、抗壞血酸0.1 g、乳酸鈉溶液（w=70%）3.5 mL，蒸餾水1 000 mL。用0.1 mol/L的NaOH溶液調節pH到中性，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。種子液培養基中涉及的試劑均為化學純。

發酵培養基：K2HPO40.5 g、NH4Cl 1.0 g、NaSO41.0 g、CaCl20.1 g、MgCl20.1 g、酵母膏1.0 g、、抗壞血酸0.1 g、巰基乙酸鈉0.1 g、FeSO4·7H20 0.2 g、乳酸鈉溶液（w=70%）3.5 mL，項目區地下水1 000 mL。發酵培養基中涉及的試劑均為工業級。使用項目區地下水分別溶解發酵培養基各組分，混合后充分攪拌混勻，調節pH為7～8后靜置6 h，使基質和環境中的雜菌生長以消耗水中溶解氧。靜置后再加入酵母膏、FeSO4·7H2O和乳酸鈉。

化學還原劑：以工業級FeSO4·7H2O配制質量分數為2%的FeSO4溶液。

土壤鉆機：7822DT型，美國Geoprobe公司。

表1 鉻污染場地土壤的基本理化性質

1.2 試驗場地位置和布局

根據勘察報告，爐渣堆放區域面積為24 474 m2，堆方量為40 172.6 m3。Cr（Ⅵ）污染物分布在污染場地西南側和東北側，總面積為 11 579 m2，深度為1.5～2.0 m。因此，試驗場地選擇在污染場地的東北側。試驗的井位布局（a）及注入井井管示意圖（b）見圖1。由圖1a可見：試驗設計3個10 m×10 m的正方形試驗區，每個試驗區間隔10 m，分別為不同的試驗組；10 m×10 m正方形試驗區再為分4個5 m×5 m的小正方形，取5 m×5 m小正方形的中心建設注入井，每個10 m×10 m正方形試驗區含有4口注入井。因為場地地下水深2 m，流向自西向東，所以試驗區塊為南北并排布局。由圖1b可見：注入井為PVC管，內徑56 mm，壁厚3.5 mm，長2.5 m，入土深度2.0 m；于PVC管下部1.6 m的管壁上縱向打4排孔，左右相鄰孔錯位排列，上下孔間隔10 mm。

1.3 試驗方法

1.3.1 微生物法

將5 L實驗室培養的硫酸鹽還原菌種子液先接種于50 L發酵培養基中，之后再擴大培養至500 L。接種量均為10%，接種后密封培養7 d。利用水泵（輸出壓力為2.5 kg）將菌劑泵入注入井，注入量（藥劑體積（L）與污染土壤質量（kg）之比）分別為5%和10%。菌劑注入到污染土壤需要一定時間在污染土壤中生長、繁殖，因此，在微生物作用1，3，5，7、14，21 d后分別采集土壤樣品，測定土壤中Cr（Ⅵ）含量及土壤浸出液中總鉻和Cr（Ⅵ）的質量濃度。此外，在0，7，14，21 d時采集土樣進行微生物菌群分析。

圖1 試驗的井位布局（a）及注入井井管示意圖（b）

1.3.2 化學還原法

按照2%的注入量將2%（w）FeSO4溶液注入污染土壤，注入方式同上。FeSO4與土壤中Cr（Ⅵ）快速反應，在注入FeSO4溶液后的1，3，5，7，14，21 d后分別采集土壤樣品，測定土壤中Cr（Ⅵ）含量及土壤浸出液中總鉻和Cr（Ⅵ）質量濃度。此外，在0，7，14，21 d時采集土樣進行微生物菌群分析。

1.4 分析方法

土壤中Cr（Ⅵ）含量的測定采用USEPA Method 3060A堿消解法［21］和USEPA 7196A比色法［22］；土壤中硫酸根含量的測定采用硫酸鋇沉淀法［23］；土壤浸出液中總鉻和Cr（Ⅵ）質量濃度的測定分別采用火焰原子吸收分光光度法［24］和二苯碳酰二肼分光光度法［25］；地下水中硫酸根質量濃度的測定采用鉻酸鋇分光光度法［26］；微生物菌群分析采用454高通量測序方法［27］。

2 結果與討論

2.1 化學還原法修復效果

化學還原法對Cr（Ⅵ）污染土壤的修復效果見圖2。由圖2可見：試驗的1～5 d，土壤中Cr（Ⅵ）含量及浸出液總鉻和Cr（Ⅵ）質量濃度均顯著下降，7 d后趨于平穩；經過21 d的修復周期，土壤中Cr（Ⅵ）含量從5.76 mg/kg 降到3.18 mg/kg（下降了44.79%），土壤浸出液Cr（Ⅵ）質量濃度從0.135 mg/L下降到0.027 mg/L（下降了80.00%），土壤浸出液中總鉻質量濃度從18.6 mg/L降為7.4 mg/L（下降了60.22%）。土壤中Cr（Ⅵ）含量基本達到修復目標值（≤3.00 mg/kg），修復后的土地質量基本符合國家一類建設用地的標準。該試驗結果與黃瑩等［6］利用FeSO4還原穩定化修復鉻污染土壤的研究結果一致，都能夠很快還原穩定化土壤中的Cr（Ⅵ）。黃瑩等所用試驗土壤中Cr（Ⅵ）含量為4 210 mg/kg，其試驗周期為45 d。

圖2 化學還原法對Cr（Ⅵ）污染土壤的修復效果

2.2 微生物法修復效果

硫酸鹽還原菌注入到鉻污染土壤中后，在Cr（Ⅵ）污染土壤中適應、生長、繁殖需要一定時間。5%菌劑注入量的微生物法對鉻污染土壤的修復效果見圖3。

圖3 5%菌劑注入量的微生物法對鉻污染土壤的修復效果

由圖3可見：試驗的1～5 d，土壤中Cr（Ⅵ）含量及浸出液總鉻質量濃度和Cr（Ⅵ）質量濃度均緩慢下降，7～14 d后浸出液Cr（Ⅵ）質量濃度下降顯著；經過21 d的修復周期，土壤中Cr（Ⅵ）含量從5.36 mg/kg降為1.25 mg/kg（下降了76.68%），土壤浸出液中總鉻質量濃度從17.8 mg/L降為5.2 mg/L（下降了70.79%），土壤浸出液Cr（Ⅵ）質量濃度從0.154 mg/L降為0.013 mg/L（下降了92.16%）。總體上，修復后的土地質量符合國家一類建設用地的標準。

10%菌劑注入量的微生物法對鉻污染土壤的修復效果見圖4。由圖4可見：土壤中Cr（Ⅵ）含量、浸出液總鉻質量濃度和Cr（Ⅵ）質量濃度的變化趨勢與5%菌劑的作用效果趨勢一致；經過21 d的修復周期，土壤中Cr（Ⅵ）含量從6.48 mg/kg降為0.95 mg/kg（下降了85.33%），土壤浸出液中總鉻質量濃度從19.2 mg/L降為4.5 mg/L（下降了76.56%），土壤浸出液Cr（Ⅵ）質量濃度從0.162 mg/L降為0.004 mg/L（下降了97.53%）。土壤中Cr（Ⅵ）含量達到修復目標值。而且，10%菌劑注入量的修復效果好于5%菌劑注入量。

圖4 10%菌劑注入量的微生物法對鉻污染土壤的修復效果

2.3 化學還原法及微生物法修復后土壤中硫酸鹽還原菌的豐度對比

硫酸鹽還原菌能夠將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）［19，26］。硫酸鹽還原菌群的豐度是微生物修復技術效果的指標之一。微生物法和化學還原法修復前后土壤中硫酸鹽還原菌豐度的對比見圖5。

由圖5可見，2%FeSO4溶液化學還原法處理鉻污染土壤后，硫酸鹽還原菌的豐度先增加后降低，從0.58%升到2.38%之后又降到1.64%。這一現象說明注入的FeSO4激活了地層中的硫酸鹽還原菌，致使硫酸鹽還原菌的豐度顯著增加；隨FeSO4在污染地層中的含量降低，硫酸鹽還原菌的豐度有所降低，但這時硫酸鹽還原菌的豐度相比注入FeSO4前增加了2倍。對比圖2可見，硫酸鹽還原菌的豐度變化趨勢也與土壤中Cr（Ⅵ）含量、浸出液中總鉻質量濃度和Cr（Ⅵ）質量濃度的變化趨勢一致。

由圖5還可見：硫酸鹽還原菌注入鉻污染地層后，硫酸鹽還原菌群的豐度顯著增加，而且10%菌劑注入量處理后的硫酸鹽還原菌豐度增加最明顯，尤其5%和10%菌劑注入量處理7 d后硫酸鹽還原菌豐度分別從0.26%和0.73%升到1.67%和3.47%，21 d后分別為1.45%和2.87%。這說明硫酸鹽還原菌能夠適應項目地土壤環境，并能夠發揮還原穩定Cr（Ⅵ）的效果。相比較化學法，10%的菌劑處理Cr（Ⅵ）污染后硫酸鹽還原菌的豐度顯著增加，處理21 d后硫酸鹽還原菌豐度比注入菌劑前高了3倍。

圖5 化學還原法和微生物法修復前后土壤中硫酸鹽還原菌豐度的對比

2.4 修復后土壤和地下水中硫酸根的含量

為了檢測菌劑和FeSO4溶液注入后是否對地下水造成負面影響，本研究測定了不同修復處理時間時土壤中硫酸根含量和地下水中硫酸根和Cr（Ⅵ）的質量濃度。測定結果表明：硫酸鹽還原菌作用后土壤中硫酸根含量略有降低，從303 mg/kg降到248 mg/kg，說明注入的硫酸鹽還原菌利用土壤中硫酸根生長繁殖，這一結果與微生物菌群分析結果對應；FeSO4處理后土壤中硫酸根含量明顯降低，從203 mg/kg降到143 mg/kg，說明FeSO4注入地層后激活了地層中的硫酸鹽還原菌，硫酸鹽還原菌的生長繁殖消耗了硫酸根。此外，測定結果還表明，地下水中Cr（Ⅵ）質量濃度一直在檢出限以下（≤0.004 mg/L），硫酸根質量濃度維持在205 ～230 mg/L，說明菌劑和FeSO4注入污染土壤后未對地下水造成負面影響。

3 結論

a）微生物法和化學還原法都能夠原位治理土壤中的Cr（Ⅵ）。微生物法修復后，土壤中Cr（Ⅵ）含量從6.48 mg/kg降至0.95 mg/kg，下降率為85.33%，修復后的土地質量符合國家一類建設用地的標準；土壤浸出液中Cr（Ⅵ）質量濃度從0.162 mg/L降至0.004 mg/L，下降率達97.53%。化學還原法修復后，土壤中Cr（Ⅵ）含量從5.76 mg/kg降至3.18 mg/kg，下降率為44.79%，修復后的土地質量基本達到國家一類建設用地的標準；土壤浸出液中Cr（Ⅵ）質量濃度從0.135 mg/L降至0.027 mg/L，下降率達80.00%。

b）微生物法和化學還原法修復后，土壤中硫酸鹽還原菌的豐度明顯增加，分別從0.73%和0.58%增加到2.87%和1.64%。

c）考慮微生物原位修復技術的低成本、長期性和環保性等特點，微生物原位法修復鉻污染土壤優于化學還原法。本研究證明微生物原位修復鉻污染土壤的可行性，為鉻污染土壤的修復開辟了新的途徑。