不同溶劑對枇杷落葉提取物的影響

潘 炘，莊曉偉，于海霞，蔣應梯，張文福，王 進

（浙江林業科學研究院，浙江省森林資源與生物質化學利用重點實驗室，浙江 杭州 310023）

枇杷Eriobotrya j aponica是薔薇科Rosaceae 枇杷屬Eriobotrya常綠小喬木。枇杷葉是一味常用傳統中藥，最早記載于《名醫別錄》[1]，具有清肺止咳、降氣化痰、抗炎、祛痰、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗癌和保肝功效[2-4]。目前，對枇杷葉中熊果酸、齊墩果酸、黃酮等成分含量分析測試的報道較多[5-6]。國內學者對枇杷葉天然產物的提取分離方式也做了大量工作[7-8]，并通過對不同時期枇杷葉主要化學成分的對比分析發現落葉期枇杷葉中的三帖酸類含量最高[9-12]，且葉為枇杷天然產物主要積累器官[13-14]。

由于收集枇杷自然落葉要比從樹上直接摘取葉片要節約大量人力，因此，本研究主要針對枇杷自然落葉中的成分進行分析研究，研究不同萃取溶劑對其多酚、多糖類等化合物提取得率的影響，為枇杷自然落葉的深加工提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019 年2-3 月，在浙江省林業科學研究院林場枇杷種植場地面收集一周內的枇杷落葉，清水洗凈，于60℃烘干，粉碎后過20 目篩，干燥器保存備用。

1.2 試驗儀器及試劑

紫外-可見光分光光計（上海精科責任有限公司）。天平BSA124s-cw（德國賽多利斯）。

福林酚試劑、單寧酸、花青素為分析純均購自Solarbio 公司，乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、鹽酸、醋酸等為化學純均購自由國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取方法 將試驗材料枇杷葉粉分別以體積比為1∶12 的水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇為溶劑索氏抽提6 h，浸出液經65℃旋轉蒸發，60℃真空干燥得提取物，并分別回配制成1 mg·mL-1的待測液，水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇為溶劑提取物，分別命名為S-1、S-2、S-3、S-4，并以重量法換算提取得率：

式中，M1為提取物干燥后的質量，M2為提取前物料質量。

所得提取物以相應溶劑復溶成1 mg·mL-1溶液4℃保存待測。

1.3.2 提取物化學成分測定

1.3.2.1 多酚化合物測定 采用福林酚比色法，標準曲線由單寧酸配制成0.30，0.15，0.075，0.038，0.019，0.01，0.005，0.002 5，0.001 2，0.000 6 mg·mL-1標準液，經反應在760 nm 波長下比色。

1.3.2.2 黃酮類化合物測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，標準曲由單寧酸配制成1.25，0.625，0.312 5，0.156，0.078，0.039，0.020，0.010，0.005 mg·mL-1標準液，經反應在470 nm 波長下比色。

1.3.2.3 總糖含量測定 采用蒽酮比色法，標準曲線由無水葡萄糖配制成0.3，0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5 mg·mL-1標準液，經反應在620 nm 波長下比色。

1.3.2.4 花青素測定 以原花青素為對照標樣，配制成5，2.5，1.25，0.625，0.312 5，0.156，0.078，0.039，0.02，0.01 mg·mL-1標準液，香草醛與60%乙醇配配成4%香草醛含量反應液，反應體系為0.4 mL 待測樣，加入0.8 mL 4%香草醛反應液，再加入0.8 mL 11%鹽酸，30℃水浴30 min，在500 nm 波長條件下比色，標準樣以蒸餾水為空白對照，待測樣以原待測樣加1.6 mL 水為本底扣除。

1.3.2.5 總抗氧化能力測定 采用FRAP 法，標準曲線由以FeSO4配制成Fe2+含量為0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25，0.003 125，0.001 56，0.000 78 μmol·mL-1的標準液，經反應在593 nm 波長下比色。FRAP 工作液由醋酸鹽緩沖液（0.3M），2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）的鹽酸溶液（10 μmol·mL-1）和FeCl3溶液（20 mmol·mL-1）按7∶1∶1 配比制得，樣品測試為0.03 mL 樣品與0.9 mL FRAP 工作液在37℃反應10 min，測試吸光度值代入標準曲線方程：

獲得樣品將Fe3+還原為Fe2+能力，單位為μmol·mg-1。進一步計算其總抗氧化能力，計算公式為：

式中，W為反應體系中的提取物質量，公式計算后單位為μmol·mg-1。所得數據均為3 次平行測定的平均值。

1.4 數據分析

測定數據均重復3 次，求其平均值。采用Excel 2010 作圖。

2 結果與分析

圖1 不同溶劑混合天然產物提取得率Figure 1 Yield of natural products extracted from E.japonica leaf by different solvents

2.1 不同溶劑對枇杷葉中混合天然產物提取得率的影響

水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇枇杷葉混合天然產物提取得率見圖1。

從圖1 可知，以水提物的得率最高，其次為正丁醇，最低為乙酸乙酯。由于抽提方式為索氏回流，提取溫度并不相同，水為100℃、乙醇為78℃、乙酸乙酯為77℃、正丁醇為117℃。在較高溫度條件下細胞組織結構的破壞更為徹底，溶劑浸出物也較多，所以在4 個溶劑中提取溫度較高的水和正丁醇的提取得率較高，其中，水提取得率高于正丁醇，表明枇杷葉中水溶性物質較多，如多糖和多酚類物質等。將四種提取物以4 種溶劑進行交互溶解試驗發現，水提物與醇提物可以在水或乙醇溶劑中互溶，未見明顯不溶物。正丁醇和乙酸乙酯提取物在水中難溶，在乙醇中可溶解大部分。水提物在正丁醇和乙酸乙酯難溶，醇提物在正丁醇和乙酸乙酯中的溶解性好于水提物，但仍有明顯不溶物存在。

2.2 不同溶劑對枇杷葉中多酚化合物提取得率的影響

圖2 多酚測定標準曲線Figure 2 Standard curve of polyphenols

圖3 不同溶劑提取多酚化合物提取得率Figure 3 Yield of polyphenols extracted by different solvents

多酚化合物的測定標準曲線見圖2，枇杷葉不同溶劑提取物多酚化合物含量見表1。由圖2 可知，枇杷葉中多酚化合物的測定標準曲線符合y=0.274 1x-0.004 5（R2=0.999 5）。從表1 可知，不同提取物中多酚化合物含量由高至低的順序為：乙醇提取 ＞ 正丁醇提取 ＞ 乙酸乙酯提取 ＞ 水提取，其中，乙醇提取物中多酚化合物的含量是正丁醇提取物的1.07 倍，水提物中多酚含量為乙醇提取物的84.3%。

表1 不同抽提物中的化合物含量與其抗氧化能力Table 1 The content of chemical components in different extracts and its antioxidant ability

枇杷葉不同溶劑的多酚化合物提取得率見圖3，其結果與表1 并不完全相同，多酚化合物的總提取得率由高至低順序為：水提取 ＞ 乙醇提取 ＞ 正丁醇提取 ＞ 乙酸乙酯提取，其中，以水提多酚得率最高，其次為醇提。這與丁建英等的研究結果并不完全一致[15]，這可能是因為丁建英等所采用提取方法為67℃超聲輔助提取，而本實驗采用提取方式為索式回流抽提，而水回流抽提溫度要高于乙醇回流抽提溫度，從而造成水提多酚化合物得率為醇提的1.29 倍。提取得率的最低的為乙酸乙酯，其提取得率僅為水提得率的39.9%。這表明在4 種溶劑中雖然水提取物中多酚化合物含量最低，但由于較高索式抽提溫度造成枇杷葉中溶出物質較多導致水提物得率較大。乙醇、正丁醇雖然溶劑極性不同、回流抽提溫度各異，但提取物中多酚化合物含量以及多酚化合物得率相似。由于酚類物質是由羥基（-OH）與芳烴核直接相連形成，因此此類成分極性較大。在4 種提取溶劑中水的極性最大。這也解釋了水提酚類成分得率高的原因。但在提取物中多酚含量最高的為醇提物，其含量為水提物1.2 倍，表明枇杷葉中多酚成分存在極性較小的組分進而造成醇提物多酚成分主成分與水提物并不完全相同，這需進一步深入研究。

黃酮類化合物是酚類物質中重要的功能成分，黃酮的測定標準曲線見圖4。從圖4 可知，黃酮標準曲線符合y=3.130 5x-0.002 5（R2=0.999 6）。

圖4 類黃酮測定標準曲線Figure 4 Standard curve of flavonoid

圖5 不同溶劑提取總黃酮類化合物得率Figure 5 Yield of total flavonoids extracted by different solvents

從表1 中可知，黃酮類成分在不同極性溶劑含量差異明顯，乙醇提取物中黃酮類化合物含量最高，為正丁醇提取物含量的1.5 倍。黃酮類化合物含量最低為乙酸乙酯提取物，僅為乙醇提取物的31%。黃酮類化合物具有2-苯基色原酮結構成分，也即以C6-C3-C6 為基本碳架的一系列化合物，因此極性差異較大，如蘆丁、5,7-二羥基黃酮和芹菜素。從表1 可知枇杷葉黃酮類化合物極性較強，而強極性、弱極性和非極性的黃酮類化合物較少。

不同溶劑總黃酮成分的提取得率見圖5。由圖可知，總黃酮類化合物得率最高的為乙醇提取，最低為乙酸乙酯提取。由于水提物得率高于正丁醇提取得率，因此，雖然水提物中總黃酮含量為正丁醇提取物的76%，但總提取得率為正丁醇提取得率的1.11 倍。所以，如果用于膏方劑用途開發，水仍是最為經濟有效和安全的溶劑。

2.3 不同溶劑對枇杷葉中總糖提取得率的影響

枇杷葉不同溶劑提取物中的總糖含量如表1 所示，總糖測定曲線標準曲線符合y=3.130 5x-0.002 5（R2=0.999 6），如圖6。

從表1 中得出，隨著溶劑極性的減小，其總糖含量也相應減小，總糖含量由高至低為：水浸提＞乙醇浸提＞正丁醇浸提＞乙酸乙酯浸提。圖7 為不同溶劑總糖提取得率。由圖7 可知，總糖提取得率與提取物含量和溶劑極性大小順序相吻合，這表明對于枇杷自然落葉中總糖的提取，極性大的水為最優的溶劑。與新鮮枇杷葉水浸提取總糖比（料液比1∶15）其得率僅低10%[16]，因此通過進一步提取工藝優化完全可以達到新鮮枇杷葉多糖提取得率。這表明自然落葉中的總糖與新鮮采摘的枇杷葉總糖含量差異不大[17]。

圖6 總糖測定標準曲線Figure 6 Standard curve of total carbohydrate

圖7 不同溶劑總糖提取得率Figure 7 Yield of total carbohydrate extracted by different solvents

2.4 不同溶劑對枇杷葉中花青素提取得率的影響

花青素是一類糖苷衍生物，花青素測定標準曲線見圖8，不同抽提物花青素含量見表1。

圖8 花青素測定標準曲線Figure 8 Standard curve of anthocyanin

圖9 不同溶劑花青素提取得率Figure 9 Yield of anthocyanin extracted by different solvents

從表1 可知，枇杷葉中不同溶劑提取物中花青素含量存在較大差異，其中，乙酸乙酯提取物中的花青素含量最高，水提物中的最低。乙酸乙酯提取物中的花青素含量為水提物中的2.9 倍，表明枇杷葉中花青素的極性較小。酯類溶劑乙酸乙酯與醇類溶劑乙醇極性相似，抽提溫度相近，但乙酸乙酯提取物中的花青素含量為乙醇提取物中的1.5 倍，由此表明，枇杷葉中花青素成分多為酯溶性而非醇溶性。圖9 為不同溶劑抽提物中的花青素得率。從圖9 中可知，花青素提取得率最高的為乙醇，最低的為正丁醇，其中，醇提花青素提取得率分別為乙酸乙酯和正丁醇的1.2 倍和1.7 倍。這也證明對花青素類植物功能成分的提取效率而言，由水、醇互溶提取再由乙酸乙酯萃取是合理的，但此類提取方式也可能會造成部分脂溶性功能成份的丟失。因此，在實際生產加工中需對目標產物進行合理分類進而選擇合適的提取工藝。

2.5 不同溶劑對枇杷葉中提取物總抗氧化能力的影響

三價鐵離子還原為二價鐵離子的能力通常用于天然產物抗氧化能力測定[18]。由表1 可知，不同溶劑提取物的抗氧化能力由高至低為乙醇提取物＞水提取物＞正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物，這與郭宇研究的結果相同[19]。不同溶劑提取物總抗氧化能力如圖10 所示。

圖10 不同溶劑對提取物抗氧化能力的影響Figure 10 Antioxidant capacity of extracts by different solvents

由圖10 和表1 可知，雖然水提物的單位質量抗氧化能力為乙醇提取物的77%，但其提取得率為醇提的1.5倍，因此，其提取物總抗氧化能力為4 種溶劑中最高。可根據枇杷葉開發產品定位選擇不同的溶劑，如以開發含總糖膏方產品為主選擇以水為主溶劑的復合提取系統。如果以進一步黃酮類成分精深分離為定位，則以乙醇為主溶劑的復合提取系統為宜。

3 討論與結論

將自然衰老離枝的枇杷葉，通過不同極性的溶劑水、乙醇、丁醇和乙酸乙酯進行索式抽提，得到提取物。通過成份分析發現，對多酚化合物而言，以乙醇提取物含量最高，而以水提取得率最高。枇杷葉水提物的總糖含量和提取得率在4 種提取液中均為最高，這也表明傳統枇杷葉膏方采用水作為溶媒是高效的[20]。正丁醇用于水提物中萃取用于去除糖類組分[21]，但試驗數據表明，正丁醇提取物含有糖類成分，說明枇杷葉中糖類成分中極性差異度較大。水與正丁醇提取物中的糖類并非同類物質，其具體組分需進一步深入研究。

對花青素成分而言，以乙酸乙酯提取物中的含量最高而以乙醇的提取得率最高。黃酮類成分以乙醇的提取得率和提取物中含量均為最高。黃酮類成分是枇杷葉中重要的功能組分，對其相應研究也較多[12,22]，通過對比試驗，水與乙醇對黃酮類成分提取得率均較高，而在實際應用中也采用了水-乙醇兩相體系用于擴大枇杷葉中黃酮的提取效率，并可有效地降低提取成本[7]。對于三價鐵離子還原能力，以乙醇提取物的單位質量還原能力最強，水提物的總還原能力最高。通過研究發現，自然衰老枇杷葉中的功能組分豐富，這與李繼楊的研究結果相似[9]，具有進一步精深加工的利用價值，且采用自然衰落的枇杷葉比采摘枇杷葉節約了大量人工費用，不同溶劑對于枇杷自然衰老葉中不同功能組分的提取存在較大差異。本研究成果可為枇杷自然衰老葉不同功能成分如多糖、黃酮類化合物萃取體系的選擇提供理論依據。