三葉崖爬藤塊根多糖復合酶法提取工藝優化及其抗氧化活性研究

胡傳久 ，韓素芳，魏海龍，鄒景泉，賀 亮，付立忠，程俊文

（1.浙江省林業科學研究院，浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；2.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 311402）

三葉崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum為葡萄科Vitaceae崖爬藤屬Tetrastigma多年生草質藤本，分布于浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、四川等地區。因遺傳基因所決定，三葉崖爬藤塊根外形呈橢圓形，但其中有許多呈酒葫蘆狀，這是其獨特的外貌特征[1-3]。藥理實驗證明三葉崖爬藤具有抗腫瘤、保肝、抗病毒、抗炎、鎮痛及解熱等藥理作用，并基本無毒[4-6]。多糖是構成植物細胞壁的主要成分，三葉崖爬藤根中的多糖是其主要活性成分之一，與纖維素、蛋白質等緊密聯結。同時，由于三葉崖爬藤根中淀粉含量較高，所以不易從中分離出活性多糖。

目前，三葉崖爬藤多糖（THPS）的提取方法多為傳統的熱水浸提法，該方法操作簡單，但提取時間長，而且高含量的淀粉會使提取液有很大的粘性，提取率低，所得多糖提取物的純度不高。生物復合酶具有水解淀粉、果膠和蛋白質的作用，酶的高效性能夠節約提取能源與時間，酶的專一性使得到的產物穩定，純度和活性高[7]。為此，本實驗采用淀粉酶、果膠酶、蛋白酶組成復合酶提取三葉崖爬藤根中的多糖，在提高多糖提取效率的同時可以有效去除多糖產物中的淀粉等雜質，避免其它物質對多糖含量測定的干擾，提高提取物中多糖的純度。另外，本文對該方法所提取的三葉崖爬藤多糖開展了體外抗氧化活性研究，旨在為三葉崖爬藤資源能夠更有效地應用于醫藥保健領域提供試驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

三葉崖爬藤根，于2017 年11 月采自浙江省磐安縣三葉崖爬藤種植基地，三年生；蛋白酶（酶活力8×104U·g-1）、果膠酶（酶活力9×104U·g-1)和淀粉酶（酶活力5×104U·g-1）均購自上海伯奧生物科技有限公司；苯酚、無水乙醇、氯仿、正丁醇均為國產分析醇，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

R-201 旋轉蒸發器，上海申勝生物技術有限公司；20B 型中藥粉碎機，南京邦斯特制藥設備有限公司；DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽，上海福瑪實驗設備有限公司；PL602-S 電子天平，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；UV-2600 紫外分光光度計，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 THPS 的提取 將當年采集到的三葉崖爬藤根先用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗晾干，然后放入真空冷凍干燥機中凍干，取干燥、潔凈的三葉崖爬藤根，用20B 型中藥粉碎機粉碎成40 目，用95%乙醇浸提12 h，抽濾，取濾渣風干粉碎備用。稱取1 g 粉末，按液料比40∶1（mL∶g）加蒸餾水混勻，根據各種生物酶的最佳酶活作用條件，在前期預實驗的基礎上，將淀粉酶、果膠酶、蛋白酶組成2∶2∶1（質量比）的復合酶，然后在一定酶解溫度、加酶量、酶解時間下進行提取，3 000 r·min-1離心10 min，上清液用95%乙醇醇沉4 h 后再經3 000 r·min-1離心5 min，沉淀用相應試驗溶劑溶解后測定。

1.3.2 響應面法分析實驗 選擇酶解溫度（X1）、加酶量（X2）、酶解時間（X3）3 個因素所確定的水平范圍，運用Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用三因素三水平的響應面設計，利用Design Expert 8.05 軟件對實驗數據進行回歸分析。自變量的試驗水平分別以-1，0，1 進行編碼，試驗因素及水平設計見表1。

1.4 項目測定

1.4.1 THPS 含量的測定 采用苯酚-硫酸比色法[8]測定三葉崖爬藤根中的多糖含量。多糖得率計算公式如下：

表1 響應面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.4.2 三葉崖爬藤多糖抗氧化能力測定 分別準確稱取提取的THPS 及維生素C（Vc）各25 mg，用蒸餾水配制成1 000 μg·mL-1溶液，并用蒸餾水分別稀釋至0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg·mL-1。

1.4.2.1 抑制DPPH·能力的測定[9]取0.04 mg·mL-1的DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）溶液2 mL，分別加入2 mL 不同濃度的THPS 和Vc 溶液后混勻，靜置30 min 后在波長517 nm 處用UV-2600 紫外分光光度計測定其吸光度為A樣品，另取濃度為50%的乙醇和待測樣品溶液各2 mL 混合，在波長517 nm 處測定其吸光度為A對照，再將2 mL DPPH 乙醇溶液與2 mL 無水乙醇混合后在波長517 nm 處測定其吸光度Ac。根據所測得的不同吸光度值計算DPPH·清除率。

1.4.2.2 清除·O2-能力的測定[9]采用鄰苯三酚自氧化法，向試管中加入0.05 mol·L-1的Tris-HCl(pH=8.2）緩沖液4.5 mL，水浴（25℃）20 min，取出后加不同濃度的THPS 和Vc 各0.l mL，0.4 mL 鄰苯三酚（2.5 mmol·L-1，25℃預熱），搖勻后水浴4 min，最后加入1 mL18 mol·L-1的HCl 終止反應，在波長560 nm 處測吸光值A1。空白組以蒸餾水代替記為A0。

按下式計算·O2-（超氧陰離子）清除率：

1.4.2.3 清除·OH 能力的測定[9]利用H2O2對Fe2+混合產生·OH（羥基自由基），加入水楊酸捕捉·OH 后產生有色物質，該物質在波長510 nm 處有最大吸收。反應體系中含有2 mL 9 mmol·L-1FeSO4、2 mL 9 mmol·L-1水楊酸-乙醇、2 mL THPS 和2 mL Vc 溶液，最后加2 mL 8.8 mmol·L-1H2O2啟動反應，37℃反應0.5 h，以蒸餾水為參比，在波長510 nm 處測定各樣品的吸光度。考慮到實驗試劑本身的吸光度，以2 mL 9 mmol·L-1水楊酸-乙醇、2 mL 9 mmol·L-1FeSO4和2 mL 不同濃度的THPS 溶液為多糖的本底吸收。

式中，A0為對照（以蒸餾水代替多糖樣品）的吸光度；Ai為添加不同濃度THPS 樣品時的吸光度；A0i為無H2O2時多糖樣品的吸光度。

1.5 數據分析[10]

采用Design-Expert 8.0.5 軟件進行數據分析、統計及作圖。

2 結果與分析

2.1 THPS 提取工藝

2.1.1 響應面分析方案及結果 根據Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，設計三因素三水平的響應面分析試驗。共有17 個試驗點，其中12 個為析因點，5 個零點試驗用以估計試驗誤差。以THPS 得率為響應值，試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案及試驗結果Table 2 Experiment design of RSM and results of RSM

2.1.2 回歸模型建立及方差分析 利用Design Expert 8.05 軟件對表2 實驗數據進行分析[9]，獲得THPS 得率對酶解溫度、加酶量、酶解時間的多元二次回歸方程：

由表3 可知，以THPS 得率為目標函數的回歸方程的回歸效果不顯著，P值基本大于0.1；模型的決定系數R2=0.954 7，說明模型與實際實驗擬合較好；校正決定系數AdjR2=0.896 4，說明該模型能解釋95.47%響應值的變化；模型的失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率，表3 中模型失擬項的P值為0.086 0＞0.05，表明模型的失擬項不顯著；根據表3 的顯著性分析結果，因素一次項X1、二次項X12以及X32對THPS 得率均呈顯著影響（P＜0.05）。綜合以上分析表明，這個模型建立的回歸方程能運用于復合酶法提取THPS 提取條件優化的理論預測。

2.1.3 響應面圖形分析 分別將模型中的酶解溫度、加酶量、酶解時間的其中一個因素固定在0水平，得到另外兩個因素的交互影響結果，二次回歸方程的響應面及其等高線如圖1、圖2 和圖3所示，各個因素及其相互間的交互作用對響應值的影響結果通過該組圖可以直觀地反映出來。極值條件應該在等高線的圓心處。由幾組圖可以看出，影響THPS提取得率的最顯著因素為酶解溫度（X1），表現為響應面變化弧度較大。加酶量（X3）酶解時間（X2）響應面弧度變化平緩，說明對響應值影響相對較小。

此外，等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[10]。從圖1 至圖3 可以看出，X1與X3之間的交互作用相對更顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA on regression model

圖1 酶解溫度和加酶量交互影響多糖得率的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 1 Surface diagram and contour for polysaccharide yield by interaction of enzymatic hydrolysis temperature and total enzyme amount

圖2 酶解溫度和酶解時間交互影響多糖得率的曲面圖和等高線圖Figure 2 Surface diagram and contour for polysaccharide yield by interaction of enzymatic hydrolysis temperature and time

圖3 加酶量和酶解時間交互影響THPS 得率的曲面圖和等高線圖Figure 3 Surface diagram and contour for polysaccharide yield by interaction of total enzyme amount and hydrolysis time

2.1.4 驗證實驗 根據 Box-Behnken 試驗所得的結果和二次多項回歸方程，利用Design Expert 8.05 進行數據分析，得到最佳提取條件為：酶解溫度51.7℃，加酶量2.8%，酶解時間92.3 min。在此條件下，THPS得率理論值可達3.97%。

為檢驗模型預測值與實際實驗值之間的相關性，即檢驗響應面優化模型的可靠性，對THPS 的提取得率進行實驗驗證。實驗中酶解溫度、加酶量和酶解時間的優化值分別為51.7℃，2.8%，92.3 min，三次平行實驗，測得THPS得率分別為3.83%，3.82%，3.87%，實際THPS 得率平均值為3.84%，達到了回歸模型預測理論值的96.7%，實驗結果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預測THPS 得率。

圖4 THPS 和Vc 對DPPH·的清除能力Figure 4 Scavenging capacity of polysaccharides and vitamin C on DPPH·

2.2 THPS 抗氧化結果

2.2.1 對DPPH·的清除能力 DPPH·是一種穩定的以氮原子為中心的自由基，DPPH·法是評價天然化合物抗氧化能力的一種有效而靈敏的方法。圖4 為THPS 和Vc 清除DPPH·的能力。由圖4 表明，THPS 對DPPH·的清除能力隨著濃度的增加而增加，呈劑量依賴性。THPS 的IC50（半抑制濃度）值為0.32 mg·mL-1。當THPS 的濃度達到0.8 mg·mL-1時，其對DPPH·的清除率為86.4%，濃度超過0.8 mg·mL-1后，清除率沒有明顯的增加。

2.2.2 清除·O2-能力的測定 THPS對·O2-的清除能力如圖5所示。由圖5中可以看出，在測試濃度范圍內，THPS表現出很強的·O2-清除能力。THPS的IC50值為0.46mg·mL-1。在0.8mg·mL-1濃度時，THPS對·O2-的抑制率為77.6%，THPS 顯示出較強的對·O2-的清除能力。

2.2.3 清除·OH 能力的測定 ·OH 是最活躍的活性氧，具有誘導作用，嚴重破壞相鄰的生物分子，導致各種疾病。圖6 為不同濃度下THPS 和Vc 清除·OH 的能力。從圖6 中可以看出，THPS 和Vc 對·OH 的清除能力都與濃度的增加有很好的相關性。在0.4 mg·mL-1濃度以下，Vc 對·OH 的抑制作用明顯強于THPS，此后隨著濃度的增加，其抑制作用不再明顯增強，而THPS 的抑制作用繼續增強。THPS 的IC50值為0.37 mg·mL-1。在0.8 mg·mL-1濃度時，THPS 對·OH 的抑制率為77.8%。

圖5 THPS 和Vc 清除超氧陰離子自由基的能力Figure 5 Scavenging capacity of polysaccharides and vitamin C on superoxide anion

圖6 THPS 和Vc 清除·OH 的能力Figure 6 Scavenging capacity of polysaccharides and vitamin C on hydroxyl radical

3 結論與討論

目前對中藥植物類中多糖的提取及其含量的測定大多采用熱水浸提，或輔以微波法、酶解法，再通過苯酚-硫酸法測定含量[11-12]。由于苯酚-硫酸法無法有效地區別淀粉與活性多糖，因此，對于像三葉崖爬藤中根莖部分的成分，由于其富含大量的淀粉類（非活性多糖）物質和果膠類粘性物質，若只是簡單地采用傳統的提取方法再通過苯酚-硫酸法測定其多糖含量，往往會使測定的真實多糖的含量偏高。為此，本實驗針對三葉崖爬藤中根莖淀粉類物質豐富的特點，采用淀粉酶、果膠酶和蛋白酶組成復合酶對三葉崖爬藤根進行酶解處理，對工藝中主要參數酶解溫度、加酶量和酶解時間等參數條件進行了實驗設計，根據Box-Benhnken 中心組合實驗設計及三因素三水平的響應面分析，通過二次多項回歸模型進行方差分析和回歸擬合，預測了三葉崖爬藤多糖的最佳提取工藝條件為：酶解溫度51.7℃，加酶量2.8%，酶解時間92.3 min。在此工藝下，其多糖得率理論值可達3.97%。驗證實驗中多糖得率平均值為3.84%，與預測值十分接近，證明了該實驗方法的穩定性。本實驗在提高多糖提取效率的同時可以有效去除多糖產物中淀粉等雜質，避免非多糖類物質對多糖含量測定的干擾，使其多糖含量測定值更加接近真實含量。

抗氧化實驗表明，三葉崖爬藤多糖具有一定的抗氧化能力，其對DPPH·，·O2-，·OH 清除作用的IC50分別為：0.32，0.46，0.37 mg·mL-1。當三葉崖爬藤多糖的濃度達到0.8 mg·mL-1時，其對DPPH·，·O2-，·OH 的清除率分別為86.4%，77.6%，77.8%。何文等也報道三葉崖爬藤多糖具有較好的抗氧化活性[14]。同時，李盛等研究表明多糖的生物活性與其多糖的單糖組成，空間構象有緊密的聯系[15]，有關三葉崖爬藤多糖生物活性與結構間的關系及三葉崖爬藤多糖作為天然抗氧化劑等產品的應用，值得進一步研究和開發。