細胞與組織凍存技術在女性生殖功能保存中的應用

王鳳偉，陳巖，覃舒婷

（廣西柳州市人民醫院，廣西 柳州）

隨著現代醫學技術的發展，許多癌癥實現早期診斷，逐漸呈現出年輕化趨勢。同時隨著早期診斷、手術、放化療等綜合措施的跟進，癌癥的生存率和治愈率有顯著提高，很多癌癥，比如乳腺癌等，在化療、內分泌治療過程中，會對女性生殖系統造成不可逆的損害，尤其乳腺癌患者如果對內分泌藥物治療不敏感，還需要做卵巢去勢可能。利用胚胎、卵母細胞或卵巢組織的冷凍保存技術，可以保持這些癌癥患者的生殖潛能。本文就細胞與組織凍存技術在女性生殖功能保存中的應用進行分析。

胚胎冷凍保存是全世界體外受精臨床上公認的常規程序，是女性癌癥患者未來獲得生殖成功的最佳選擇。然而，由于它需要精子來源，許多年輕的單身女性如不接受供精，則不能選擇胚胎冷凍保存生育功能。此外，由于倫理、宗教和社會原因，獲取胚胎和隨后儲存胚胎可能存在其他各種限制。在這些情況下，卵母細胞冷凍可能是更優的一種選擇。美國生殖醫學學會（ASRM）和美國臨床腫瘤學會（ASCO）已將卵母細胞冷凍保存作為“癌癥和其他需要治療的疾病對婦女未來生育能力構成嚴重威脅的生育保護策略”[1]。然而，卵母細胞冷凍保存需要卵巢刺激，因此可能導致癌癥治療的延遲。

卵巢組織冷凍保存技術是保留生育功能另一重要方法，卵巢組織凍存不需要進行卵巢刺激，因此可以不用延遲治療時間，尤其是對青春期前的女性也可適用。這種方法對卵巢組織（切片/碎片）進行超低溫保存，可以儲存大量原始卵泡和初級卵泡，在合適的時間進行凍存卵巢組織的再移植，以獲取生育功能。來自四個歐洲醫學中心進行的統計顯示，這種卵巢自體移植術后妊娠率可達25%[2]。卵巢的自然可塑性有助于移植到不同的部位，在這些部位，卵巢可以重新血管化，并迅速恢復其正常生理。卵巢組織可以原位移植到骨盆或異位移植到皮下、腎及卵巢包膜或肌肉[3]。無論移植部位如何，卵巢移植都可能發生缺血和潛在的卵泡閉鎖，這對該技術的成功提出了挑戰。因此，在卵巢移植時，必須保證移植體與宿主組織之間有良好的細胞通訊。同時需注意的是，這種自體移植也可能存在再次引入癌細胞的風險。雖然確切的風險還不清楚，但癌癥患者的尸檢顯示，不同癌癥類型轉移到卵巢的概率可達8.4%～55%[4]。目前研究顯示，白血病患者在進行卵巢組織凍存自體移植后，再次引入惡性細胞的風險率最高，因此，患有盆腔或血液學惡性腫瘤的婦女可能不是卵巢組織移植的合適人選。為了規避這種風險，異種移植和卵母細胞體外成熟技術可能成為另外的選擇。將凍融的卵巢組織移植到動物宿主體內，隨后收集成熟卵母細胞，可以提供相當大的優勢。通過這種技術，可以消除癌癥傳播和復發的可能性；有研究已經可以從異種移植的卵巢組織中獲得M Ⅱ期卵母細胞[5]。如結合卵母細胞體外成熟技術的應用，似乎可為有需要的女性提供更多選擇。

卵母細胞體外成熟相較卵母細胞冷凍保存可能具有一些優點，如不需要促排卵，同時消除了胚胎冷凍的宗教和/或其他倫理、法律和道德問題。未成熟卵母細胞可以從體內或體外獲得，體內獲得主要通過取卵技術，現多應用于多囊卵巢綜合征患者，以降低卵巢過度刺激的發生率，目前應用該方法已經有許多健康分娩的報道[6]。從體外新鮮卵巢組織或凍存卵巢組織中獲得未成熟卵母細胞主要適用于腫瘤患者，優點是可以防止癌細胞擴散，且避免了自體移植將腫瘤細胞再次引入體內的風險。2014 年，Prasath EB 等人首次通過對卵巢癌患者切除的卵巢中獲得未成熟卵母細胞進行IVM 后凍存，后經體外受精胚胎移植獲得活產[7]。

目前關于卵巢組織及細胞的凍存方法主要有傳統的慢速冷凍和玻璃化凍存法。在傳統的緩慢冷凍中，組織或細胞以可編程的方式緩慢冷卻至約140 ℃，然后將組織放入196 ℃的液氮中用于儲存[8]，但是，對于大組織切片或整個器官來說，由于組織核心及表面的非均勻的冷卻速率，及細胞內冰晶的形成，容易造成嚴重的細胞損傷[9]，這種損傷可以通過提高表面體積比來減少，即需要盡可能小的樣本，但對于凍存卵巢組織來說，過小的卵巢組織切片不利于保存大量的卵泡。同時也不適用于整個卵巢的保存。凍存前應用冷凍保護劑溶液能夠能夠穿透組織到足夠的深度，防止冰晶形成的傷害，但解凍后，必須及時去除冷凍保護劑，因為一旦組織或器官處于生理溫度，這些冷凍保護劑就可能對組織產生毒害作用。玻璃化冷凍是一種避免冰晶形成的過程，將組織或細胞暴露于高濃度的冷凍保護劑中，然后在-210 ℃的溫度下迅速冷卻至液氮中[10]，能夠消除卵巢組織中形成冰晶的風險。玻璃化法與慢速冷凍法的不同之處在于冷凍保護劑的濃度（高）和冷卻速度（快）。在對卵巢組織進行玻璃化冷凍和慢速冷凍，然后進行組織培養以評估隨后的卵母細胞存活率的系統性比較中，兩種方法卵母細胞存活率相似，但玻璃化冷凍可提高顆粒細胞存活率和基質完整性[11]。另一項研究提示，與慢速冷凍相比，對人囊胚的玻璃化冷凍有更高的復蘇率和妊娠率[12]。雖然最初的數據顯示卵巢組織玻璃化冷凍可能是更有利的方法，但在玻璃化冷凍取代慢速冷凍作為卵巢組織冷凍保存的標準方法之前，還需要進行更多的研究，尤其是高濃度的冷凍保護劑誘導細胞毒性和滲透性損傷和玻璃化安全性的問題。

總之，細胞與組織凍存技術在保留女性生育功能中發揮重要的、甚至不可替代的作用，也幫助了內分泌治療不敏感的部分乳腺癌患者，讓他們在選擇卵巢去勢治療的同時，生育功能的需要得到保障。